Summary
Wir stellen eine Methode zur Prüfung von BRCA1-Varianten in einer Gewebekultur basierter Assay für die homologe Rekombination Reparatur von DNA-Schäden, die durch abbauende endogenen BRCA1-Protein aus einer Zelle mit RNAi und ersetzt sie mit einer BRCA1 Punktmutante, dass eine Codierung ändern enthält.
Abstract
Die funktionelle Analyse von Missense-Mutationen können durch die Anwesenheit in der Zelle des endogenen Proteins kompliziert sein. Struktur-Funktions-Analysen des BRCA1 haben durch das Fehlen einer robusten Assay für die volle Länge BRCA1-Protein und die Schwierigkeiten in der Arbeit mit Zelllinien, die hypomorphen BRCA1-Protein 1,2,3,4,5 äußern kompliziert. Wir entwickelten ein System, bei dem endogenen BRCA1-Protein in einer Zelle akut durch RNAi-Targeting der 3'-UTR des BRCA1 mRNA erschöpft war und durch Co-Transfektion eines Plasmids, das eine BRCA1-Variante. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die akute Schweigen der Gene BRCA1 und gleichzeitigen Austausch der Zellen ohne sekundäre Mutationen oder Anpassungen, die im Laufe der Zeit entstehen könnten, um den Verlust von BRCA1-Funktion kompensieren wachsen lassen. Dieser Abbau und Add-back-Verfahren wurde in einem HeLa-derived-Zelllinie, die leicht für die homologe Rekombination Aktivität wurde untersucht getan. Die homologe Rekombination Test basiert auf einem bereits veröffentlichten Methode, bei der eine Rekombination Substrat in das Genom (Abbildung 1) 6,7,8,9 integriert ist. Diese Rekombination Substrat hat die seltene-Schneid I-SceI Restriktionsenzymstelle in einem inaktiven GFP-Allel und nachgeschaltet ist eine zweite inaktive GFP-Allel. Transfektion der Plasmid, das I-SceI Ergebnisse drückt in einem doppelsträngigen Pause, die durch homologe Rekombination repariert werden kann, und wenn homologe Rekombination nicht reparieren der Pause schafft eine aktive GFP-Allel, das ist leicht mittels Durchflusszytometrie für GFP-Protein-Expression erzielt . Depletion von endogenen BRCA1 führte zu einer 8-10-fache Reduktion der homologen Rekombination Aktivität und Hinzurechnung von Wildtyp-Plasmid vollständig restauriert homologe Rekombination Funktion. Wenn bestimmte Punktmutanten in voller Länge BRCA1 von co-transfiziert Plasmiden exprimiert wurden, konnte die Wirkung des spezifischen Missense-Mutanten erzielt werden. Als ein Beispiel, der Ausdruck des BRCA1 (M18T)-Protein, eine Variante des unbekannten klinische Bedeutung 10, in diesen Zellen exprimiert wurde, unterließ es BRCA1-abhängigen homologen Rekombination wiederherstellen. Im Gegensatz dazu Ausdruck einer anderen Variante auch von unbekannter Bedeutung, BRCA1 (I21V) voll BRCA1-abhängigen homologen Rekombination Funktion wiederhergestellt. Diese Strategie der Prüfung der Funktion des BRCA1 Missense-Mutationen wurde in einen anderen biologischen System Testen auf Zentrosomenfunktion (Kais et al, unveröffentlichte Beobachtungen) angewendet worden. Insgesamt ist dieser Ansatz für die Analyse von Missense-Mutanten in einem Gen, das rezessiv analysiert werden müssen.
Protocol
1. Cell Line mit integriertem Rekombination Substrate
- Die HeLa-Zellen wurden stabil mit PDR-GFP (Plasmid 7 Geschenk von M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) umgewandelt und gepflegt in Puromycin für die Auswahl der Transformanten.
- Die Zellen werden in DMEM / FBS passagiert, mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamax, 1 mM Natriumpyruvat, Penicillin / Streptomycin (100 U / mL/0.1 mg / mL) und 1,5 ug / ml Puromycin.
Die Rekombination Substrat in der PDR-GFP-Plasmid, und in stabilen Transformanten, enthält zwei inaktive Allele von GFP (Abbildung 1). Ein Allel ist inaktiv wegen der Aufnahme in deren kodierende Sequenz des 18 bp Restriktionsenzym Erkennungssequenz für I-SceI. Die Expression von I-SceI in diesen Zellen erzeugt eine doppelsträngige DNA (DSB). Es gibt eine zweite Allel des inaktiven GFP auf dieser DNA, sondern den Teil seiner Sequenz mit der I-SceI auf dem ersten Allel korreliert ist Wildtyp. Diese zweite GFP-Allels kann als eine Folge der Geber für die homologe Rekombination Reparatur der DSB-Funktion und würde in eine aktive GFP-Allels, die sich leicht mittels Durchflusszytometrie detektiert führen. Alternativ könnte der DSB durch homologe End-Verbindung, welche die I-SceI Restriktionsstelle zerstören würde und in GFP-negativen Zellen führen repariert werden. Die Höhe der homologen Rekombination in einer Zelle wird durch das Zählen der Anteil der GFP-positiven Zellen bestimmt.
Diese Zelllinie, pHeLa-DR13-9, wurde bei allen Klonen für Null-Hintergrund GFP-Signal und ein relativ hoher Prozentsatz von GFP-positive Zellen nach Transfektion mit dem I-SceI exprimierenden Plasmid, pCBASce ausgewählt. (Die pCBASce und Vektor-Regelung, pCAGGS, wurden beide von M. Jasin des Memorial Sloan-Kettering Cancer Center geliefert.)
Die HeLa-DR13-9-Zelllinie ist von den Autoren auf Anfrage erhältlich.
2. Transfektion zu einem Abbau endogener Gene BRCA1 und Add Zurück Mutant BRCA1.
- Am Tag vor der ersten Transfektion (in der Regel Dienstag): mit einer 10 cm Schüssel mit HeLa-DR13-9-Zellen mindestens 90% konfluent Begin.
- Trypsinize in 1 mL und stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 9 ml DMEM / FBS, gut mischen durch Pipettieren.
- Add 40 ul trypsiniert Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte in 0,5 ml DME / FBS.
- Tag 1 Transfektionen (Mittwoch): Zellen sollten ~ 40-50% konfluent sein, wenn viel weniger anfangen. Transfizieren durch Mischen: 5 pmol siRNA + 0,3 ug BRCA1-Mutanten exprimierenden Plasmid DNA in 12,5 ul Opti-MEM und 0,5 ul Lipofectamine 2000 in 12,5 ul Opti-MEM. Fahren Sie mit der Transfektion nach dem Lipofectamine Protokoll (Invitrogen).
- Ersetzen Sie die Medien 4-6 Stunden später. Die siRNA wir nutzen, um BRCA1 führen auf die Reihenfolge GCUCCUCUCACUCUUCAGU Angabe BRCA1 3'-UTR-Sequenzen 80.780 bis 80.798 (Zugangsnummer AY273801) basiert.
- Tag 2: Transfer der Zellen durch trypsinizing von der 24-Well-Platte zu einer 6-Well-Platte.
- Tag 3 Transfektionen: 25 pmol siRNA + 0,75 ug BRCA1-Mutanten exprimierenden Plasmid DNA + 0,75 ug pCBASce (oder pCAGGS vector control) in 62,5 ul Opti-MEM und 2,5 ul Lipofectamine 2000 in 62,5 ul Opti-MEM. Ersetzen Sie die Medien 4-6 Stunden später.
3. Die Analyse der Transfektanten.
- Am Tag 6, trypsinize Zellen aus jeder Vertiefung und stoppen in 1 ml DMEM / FBS. Analysieren der Zellen für die GFP-Expression kann an den Tagen 5 oder 7 gemacht werden, aber wir finden, dass Tag 6 am besten funktioniert.
- Analysieren 10.000 Zellen pro Vertiefung mittels Durchflusszytometrie. Wir verwenden eine Becton Dickinson FACSCalibur Instrument in der Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical Cytometry freigegebenen Ressource. Single, lebende Zellen sind gated mit der Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht-Parameter. GFP-positiven Zellen werden unter Verwendung der GFP-Fluoreszenz-Detektor (FL1), und die Ergebnisse werden als Histogramm (Abbildung 2, unten) dargestellt.
- Übrig Zellen können für die Fotografie durch Fluoreszenzmikroskopie replattiert werden, falls gewünscht.
4. Repräsentative Ergebnisse:
BRCA1 regelt den Weg für die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen durch homologe Rekombination 6,11. Jene Zellen, die Reparatur unterzogen haben, durch homologe Rekombination werden leicht durch Fluoreszenzmikroskopie (Abbildung 2, oben) nachgewiesen. Depletion von BRCA1 führt zu einer Abnahme der detektierten GFP-positiven Zellen (Abbildung 2, rechts). Die Ausgabe aus dem FACSCalibur ist ein Histogramm mit GFP-Intensität pro Zelle auf der X-Achse und die Anzahl der Zellen auf der Y-Achse (Abbildung 2, unten). In einem typischen Satz von Ergebnissen aus einem einzigen Experiment wurden 15,5% der Zellen GFP-positive nach I-SceI Ausdruck und Kontrolle RNAi Depletion (Abbildung 3). Zum Vergleich: add Erschöpfung der BRCA1-und Vektor zurück GFP-Umstellung auf 0,7% reduziert. Add-back von Wildtyp-BRCA1 oder BRCA1 (I21V) vollständig wiederhergestellt homologe Rekombination, wie durch den Erwerb 15-16% GFP-positive Zellen nachgewiesen. Add-back des BRCA1 (M18T)-Mutante (Abbildung 3, Spur 5) hatte ähnliche Wirkung wie das Add-back des Vektor-Regelung. Da diese Variante auf ähnlichem Niveau wie das endogene Protein 9 ausgedrückt, wir so interpretieren die BRCA1 (M18T) Variante ist nicht funktionsfähig in homologe Rekombination.
Wir haben in der Regel 10-20% der Zellen zu konvertieren GFP-positive nach Transfektion der I-SceI Expressionsplasmid. Depletion von BRCA1 reproduzierbar reduziert die Umwandlung von GFP-positiven Zellen um etwa 8-10 fache. Obwohl der tatsächliche Anteil der GFP-positive Zellen können von Experiment zu Experiment, das Verhältnis von GFP-positive Zellen nach BRCA1 Abbau bezogen auf die Kontrolle Abbau innerhalb eines Experiments zu ändern ist ziemlich konstant. Wir normieren Ergebnisse, indem Sie die ungehemmte Umrechnungskurs zu 100% und Express-Ergebnisse mit BRCA1 Abreicherungen und Hinzurechnungen in Prozent. Auf diese Weise können wir kombinieren mehrere Experimente, und die experimentelle Variation ist nicht hoch.
Add Rückseite des BRCA1-Mutanten haben bisher ergeben robuste Ergebnisse: jeweils BRCA1-Variante hat entweder vollständig homologe Rekombination Aktivität wieder hergestellt hat oder hatte keine Wirkung. Eine wichtige Überlegung bei der Erlangung dieser Ergebnisse ist, dass unsere Transfektionsbedingungen Ebenen des BRCA1-Protein, das etwa gleich der Konzentration des endogenen Proteins in unbehandelten Zellen zu produzieren. Zu hohe einer Überexpression von selbst eine defekte Mutante von BRCA1 in manchen positive homologe Rekombination Aktivität führen.
Ein Problem, das wir zu überwinden brauchte, war die Toxizität der Transfektion. Depletion von BRCA1 selbst kann langsam das Zellwachstum, und das Gleichgewicht der Lipofectamine-2000 und Plasmid-DNA bezogen auf die Anzahl der Zellen auf der Schale muss ein einheitliches Niveau gehalten werden. Zu viel Lipofectamine oder Plasmid-DNA reduzieren Zellzahlen und die Anzahl der Zellen nicht ausreichen werden, um zuverlässige Durchflusszytometrie Ergebnisse zu erhalten. Der Saldo aus dem Plasmid und Lipofectamine Reagenzien im Vergleich zu der Anzahl der Zellen transfiziert ist sehr wichtig für die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen.
Abbildung 1. Die Rekombination Substrat. Die Strategie, die von der Gruppe von M. Jasin 7,12 entwickelt worden war dargestellt. Die PDR-GFP-Plasmid enthält zwei defekte Allele von GFP, von denen ein I-SceI Restriktionsendonukleasestelle enthält. Ein HeLa abgeleitete Zelllinie enthält dieses DNA-Substrat an einem Ort im Genom 9 integriert und aktiv die Reparatur der doppelsträngigen DNA-Pause auf der I-SceI Ort durch homologe Rekombination Ergebnisse bei der Umwandlung von einem Allel zu GFP-positiv.
Abbildung 2. Erkennung von GFP-positiven Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie. Die Zellen wurden nach diesem Protokoll getestet und Kontrolle verarmten Zellen wurden in der homologen Rekombination aktiv, wie durch einen hohen Anteil von Zellen mit GFP-Expression (links) erkannt. Depletion von BRCA1 durch RNAi führt zu einem starken Rückgang in der Zahl der GFP-positiven Zellen (rechts).
Abbildung 3. Ergebnisse einer Hinzurechnung von BRCA1 Missense-Mutanten. Ergebnisse aus einem einzigen Experiment sind in diesem Histogramm angezeigt. In Abwesenheit von transfizierten I-SceI exprimierenden Plasmid (Spur 1) gibt es keine GFP-positive Zellen nachgewiesen. Die Ergebnisse in den Spuren 2-6 wurden alle aus Zellen, in denen die I-SceI exprimierenden Plasmid am Tag 3 transfiziert wurde. In Zellen, die für eine irrelevante Gen (Luciferase) aufgebraucht waren und mit Vektor-add-back, waren 15,5% der Zellen GFP-positive (Spur 2). Depletion von BRCA1-und Vektor-add-back zeigt die Wirkung der Verlust von BRCA1 auf homologe Rekombination (Spur 3). Die Auswirkungen der Verarmung der Gene BRCA1 und Hinzurechnung von Wildtyp-BRCA1 (Bahn 4), BRCA1 (M18T) (Spur 5) und BRCA1 (I21V) (Spur 6) werden angezeigt. Diese Ergebnisse stammen aus einem Experiment, und würde mit mindestens zwei weitere Experimente zu wiederholen kombiniert werden, um ein Maß für die homologe Rekombination von einem mutierten BRCA1-Protein unterstützt zu erhalten.
Discussion
Der Vorteil dieser Methode ist, dass wir die Funktion des BRCA1-Protein bei der Regulation der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die Wildtyp-endogen exprimierten Gene BRCA1 haben zu studieren. Wir verfügen über zwei separate etablierten Methoden der Untersuchung der homologen Rekombination und der Nutzung RNAi-vermittelten Abbau der neuartigen Methode zum Testen von BRCA1-Varianten für die Funktion der DNA-Reparatur erhalten hat. Der Schlüssel für den Erfolg dieser Methode war es, eine leicht transfizierbare Zelllinie, wie HeLa etablieren, mit der Rekombination Substrat in das Genom, so dass wir sehr hohe GFP Umsatz zu erreichen. Wir hatten mehrere Klone des ursprünglichen Transformation, um gesiebt, um eine, die keine nachweisbaren Hintergrund GFP-Signal war zu erhalten, sondern auf die Transfektion der I-SceI Expressionsplasmid hatte ein sehr hohes Maß an GFP-Konvertierung.
Mit dieser Methode sind wir nun untersuchen andere spezifische BRCA1 Aminosäurereste für die Funktion in der homologen Rekombination. Zusammen mit der biologischen Erkenntnisse aus dieser Arbeit lassen sich diese Schlussfolgerungen für die klinische Krebsgenetik angewendet werden. Ein hoher Prozentsatz der BRCA1 Missense-Mutationen haben unbekannte klinische Bedeutung, da es viele seltene Varianten und es gibt nicht genügend Informationen für viele dieser, um den Krebs Verein durch genetische Segregationsanalyse 3,10,13,14 zu bestimmen. Mit dieser Methode könnten die Folgen einer spezifischen Variante der biologischen Funktion von BRCA1 bei der Regulierung der homologen Rekombination zur Frauen, die eine dieser Varianten tragen in ihrem Genom zu informieren.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir sind dankbar für die Ohio State University Comprehensive Cancer Center für die Bereitstellung von Mitteln für diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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