Summary
Vi erbjuder en metod för att testa BRCA1 varianter i en vävnad kultur baserad analys för homolog rekombination reparation av DNA-skador av ozonnedbrytande endogena BRCA1 protein från en cell med hjälp av RNAi och ersätta den med en BRCA1 punkt mutant som innehåller en kodning förändring.
Abstract
Den funktionella analysen av missense mutationer kan kompliceras av att det i cellen av endogena protein. Struktur-funktion analyser av BRCA1 har komplicerats av att det saknas en robust analys för fulla längd BRCA1 protein och de inneboende svårigheterna i att arbeta med cellinjer som uttrycker hypomorphic BRCA1 protein 1,2,3,4,5. Vi utvecklade ett system där de endogena BRCA1 protein i en cell blev akut utfiskade av RNAi inriktning på 3'-UTR för BRCA1 mRNA och ersättas av samarbete transfecting en plasmid som uttrycker en BRCA1-variant. En fördel med detta förfarande är att den akuta ljuddämpning av generna BRCA1 och samtidig ersättning låta cellerna att växa utan sekundära mutationer eller anpassningar som kan uppstå med tiden för att kompensera för förlusten av BRCA1 funktion. Denna utarmning och add-back-förfarande gjordes i en HeLa som härrör cellinje som lätt var analyserade för homolog rekombination aktivitet. Den homolog rekombination analysen är baserad på en tidigare publicerad metod där en rekombination substrat är integrerad i arvsmassan (Figur 1) 6,7,8,9. Denna rekombination substrat har den sällsynta skär I-SCEI plats restriktionsenzymanalys inuti en inaktiv GFP-allel, och nedströms en andra inaktiv GFP allel. Transfektion av plasmiden som uttrycker I-SCEI resulterar i en dubbel-strängat paus, som kan repareras av homolog rekombination, och om homolog rekombination inte reparera sönder det skapar en aktiv GFP allel som lätt görs med flödescytometri för GFP protein expression . Utarmning av endogena BRCA1 resulterade i en 8-10-faldig minskning av homolog rekombination aktivitet, och lägga tillbaka av vild-typ plasmid helt återställd homolog rekombination funktion. När specifik punkt mutanter av full längd BRCA1 uttrycktes från co-transfekterade plasmider, kan effekten av den specifika missense mutant görs. Som ett exempel, var ett uttryck för BRCA1 (M18T) protein, en variant av kliniska signifikansen 10, uttryckt i dessa celler, misslyckades den med att återställa BRCA1-beroende homolog rekombination. Däremot uttryck för en annan variant, också av okänd betydelse, BRCA1 (I21V) helt återställd BRCA1-beroende homolog rekombination funktion. Denna strategi för att testa funktionen hos BRCA1 missense mutationer har tillämpats på ett annat biologiskt system testmetoder för centrosome funktion (Kais et al, opublicerade observationer). Sammantaget är denna metod lämplig för analys av missense mutanter i en gen som måste analyseras recessivt.
Protocol
1. Cell linje med en integrerad Rekombination Substrat
- Den HeLa celler var stabilt förvandlas med PDR-GFP (plasmid 7 gåva från M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) och hållas i puromycin för val av transformants.
- Cellerna är passerats in DMEM / FBS, innehållande 10% fetalt bovint serum, 2 mm GlutaMAX, 1 mm natrium pyruvat, penicillin / streptomycin (100 E / mL/0.1 mg / ml) och 1,5 mg / ml puromycin.
Den rekombination substrat i PDR-GFP plasmid, och i stabila transformants, innehåller två inaktiva alleler av GFP (Figur 1). En allel är inaktiv på grund av att det i sin kodning sekvens av de 18 bp restriktionsenzymanalys erkännande sajt för I-SCEI. Redovisning av I-SCEI i dessa celler skapar ett dubbelsträngat DNA break (DSB). Det finns en andra allelen av inaktiva GFP på denna DNA, men den del av dess sekvens korrelerad med I-SCEI plats på första allelen är vild-typ. Denna andra GFP-allelen kan fungera som en sekvens givare för homolog rekombination reparation av DSB och skulle resultera i en aktiv GFP allel, som lätt upptäcks av flödescytometri. Alternativt kan DSB repareras av nonhomologous slutet att gå, vilket skulle förstöra I-SCEI begränsning platsen och skulle resultera i GFP-negativa celler. Nivån på homolog rekombination i en cell bestäms genom att räkna andelen GFP-positiva celler.
Denna cellinje, pHeLa-DR13-9, valdes bland alla kloner för noll bakgrund GFP-signal och en relativt hög andel av GFP-positiva celler på transfektion med I-SCEI uttrycka plasmid, pCBASce. (Den pCBASce och dess vektorstyrning, pCAGGS, båda levererade av M. Jasin av Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.)
Den HeLa-DR13-9 cellinje är tillgänglig från författarna på begäran.
2. Transfektion att tömma Endogena BRCA1 och lägga tillbaka Mutant BRCA1.
- Dagen före den första transfektion (vanligtvis en tisdag): Börja med en 10 cm parabolantenn i HeLa-DR13-9 celler minst 90% konfluenta.
- Trypsinize i 1 ml och stoppa reaktionen genom att tillsätta 9 ml DMEM / FBS, blanda väl genom att pipettera.
- Tillsätt 40 mikroliter av trypsinized celler per brunn på en 24 brunnar i 0,5 ml av DME / FBS.
- Dag 1 transfections (onsdag): celler bör ~ 40-50% konfluenta, om än mindre börja om. Transfektera genom att blanda: 5 pmol siRNA + 0,3 ug BRCA1-mutant uttrycka plasmid-DNA i 12,5 mikroliter Opti-MEM, och 0,5 mikroliter Lipofectamine 2000 i 12,5 mikroliter Opti-MEM. Fortsätt med transfektion enligt Lipofectamine protokollet (Invitrogen).
- Byt medierna 4-6 timmar senare. Den siRNA vi använder för att tömma BRCA1 bygger på sekvensen GCUCCUCUCACUCUUCAGU ange BRCA1 3'-UTR sekvenser 80.780 till 80.798 (anslutning nummer AY273801).
- Dag 2: Transfer cellerna genom trypsinizing från 24 brunnar till en 6 brunnar.
- Dag 3 transfections: 25 pmol siRNA + 0,75 ug BRCA1-mutant uttrycka plasmid-DNA + 0,75 ug pCBASce (eller pCAGGS vektorstyrning) i 62,5 mikroliter Opti-MEM och 2,5 mikroliter Lipofectamine 2000 i 62,5 mikroliter Opti-MEM. Byt medierna 4-6 timmar senare.
3. Analys av Transfectants.
- På dag 6, trypsinize celler från varje brunn och stannar i 1 ml DMEM / FBS. Analysera cellerna för GFP uttryck kan göras på dag 5 eller 7, men vi anser att dagen 6 fungerar bäst.
- Analysera 10.000 celler per brunn med flödescytometri. Vi använder en Becton Dickinson FACSCalibur instrument i Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytisk Cytometry delad resurs. Singel, levande celler är gated med de främre och Side Scatter parametrar. GFP-positiva celler detekteras med hjälp av GFP fluorescens detektor (FL1), och resultatet presenteras som ett histogram (figur 2, längst ner).
- Kvar celler kan replated för fotografering av fluorescensmikroskopi om så önskas.
4. Representativa resultat:
BRCA1 reglerar väg för reparation av dubbelsträngat DNA bryts av homolog rekombination 6,11. De celler som har genomgått reparation av homolog rekombination är lätt upptäcks av fluorescensmikroskopi (Figur 2, övre). Utarmning av BRCA1 resulterar i en minskning av det upptäckta GFP-positiva celler (Figur 2, höger). Produktionen från FACSCalibur är ett histogram med GFP intensitet per cell på X-axeln och antal celler på Y-axeln (figur 2, längst ner). I en typisk uppsättning av resultat från ett enda experiment, var 15,5% av cellerna GFP-positiva efter jag-SCEI uttryck och kontroll RNAi utarmning (Figur 3). Som jämförelse kan lägga utarmning av generna BRCA1 och vektor minskad tillbaka GFP-konvertering till 0,7%. Återläggning av vildtyp BRCA1-eller BRCA1 (I21V) helt återställd homolog rekombination, som upptäcks genom att erhålla 15-16% GFP-positiva celler. Återläggning av BRCA1 (M18T) mutant (Figur 3, Lane 5) hade liknande effekt som tillägg baksidan av vektorstyrning. Eftersom denna variant uttrycks på liknande nivåer som det endogena proteinet 9, tolkar vi därmed BRCA1 (M18T) variant är icke-funktionella i homolog rekombination.
Vi har normalt 10-20% av cellerna konvertera till GFP-positiva efter transfecting I-SCEI uttryck plasmid. Utarmning av BRCA1 minskar reproducerbart omvandlingen av GFP-positiva celler med ca 8-10 gånger. Om den faktiska andelen GFP-positiva celler kan förändras från experiment till experiment, förhållandet mellan GFP-positiva celler efter BRCA1 uttunning i förhållande till kontrollen utarmning i ett experiment är ganska konsekvent. Vi normalisera resultat genom att ställa ohämmade omräkningskursen till 100% och uttrycka resultat med BRCA1 kundledet och add-ryggar som procenttal. På detta sätt kan vi kombinera flera experiment, och experimentell variation är inte hög.
Lägg till baksidan av generna BRCA1 mutanter har hittills gett goda resultat: varje BRCA1 varianten har antingen helt återställd homolog rekombination aktivitet eller har haft någon effekt. En viktig fråga att erhålla dessa resultat är att våra transfektion villkor producera nivåer av generna BRCA1 protein som ungefär lika stora koncentrationen av kroppsegna proteinet hos obehandlade celler. För hög för ett överuttryck av ännu en defekt mutant av generna BRCA1 kan medföra vissa positiva homolog rekombination aktivitet.
Ett problem som vi behövde för att övervinna var toxicitet transfektion. Utarmning av BRCA1 sig kan bromsa celltillväxt, och balansen mellan Lipofectamine-2000 och plasmid-DNA i förhållande till antalet celler på skålen måste hållas på en jämn nivå. För mycket Lipofectamine eller plasmid-DNA kommer att minska cell nummer, och antalet celler som kommer att vara otillräckliga för att få tillförlitliga resultat flödescytometri. Återstoden av plasmiden och Lipofectamine reagenser kontra antalet transfekterade celler är mycket viktigt för att bevara livskraften i cellerna.
Figur 1. Rekombination substrat. Den strategi som utvecklats av den grupp av M. Jasin 7,12 avbildas. PDR-GFP plasmid innehåller två defekta alleler av GFP, varav en innehåller en I-SCEI plats begränsning endonuclease. En HeLa härstammar cellinje innehåller denna DNA-substrat integrerade på ett enda ställe i arvsmassan 9 och aktiv reparation av dubbelsträngat DNA paus på I-SCEI webbplats med hjälp av homolog rekombination resultat i omvandling av en allel för att GFP-positiva.
Figur 2. Detektion av GFP-positiva celler genom fluorescensmikroskopi. Celler testades enligt detta protokoll, och kontroll-utarmat celler var aktiva i homolog rekombination, som upptäckts av en hög andel celler med GFP uttryck (till vänster). Utarmning av BRCA1 av RNAi resulterar i en kraftig minskning av antalet GFP-positiva celler (höger).
Figur 3. Resultat av ett tillägg baksidan av BRCA1 missense mutanter. Resultat från ett enda experiment visas i detta histogram. I avsaknad av transfekterade I-SCEI uttrycka plasmid (Lane 1) Det finns inga GFP-positiva upptäckt celler. Resultaten i gränderna 2-6 var alla tagna från celler där I-SCEI uttrycka plasmid var transfekterade på dag 3. I celler som var utarmat efter ett irrelevant gen (luciferas) och vektor add-back, var 15,5% av cellerna GFP-positiva (Lane 2). Utarmning av generna BRCA1 och vektor lägga tillbaka visar effekten av förlusten av generna BRCA1 på homolog rekombination (Lane 3). Effekterna av utarmning av generna BRCA1 och tillägg baksidan av vildtyp BRCA1 (Lane 4), BRCA1 (M18T) (lane 5) och BRCA1 (I21V) (körfält 6) visas. Dessa resultat är från ett enda experiment, och skulle kombineras med minst två fler återkommande experiment för att få ett mått på homolog rekombination stöds av en viss muterad BRCA1-protein.
Discussion
Fördelen med denna metod är att vi kan studera funktionen hos BRCA1 protein i regleringen av DNA-reparation av homolog rekombination använda celler som har vildtyp endogent uttryckta BRCA1. Vi har antagit två olika etablerade metoder för att studera homolog rekombination processen och utnyttja RNAi-medierad utarmning att få ny metod för att testa BRCA1 varianter för funktion i DNA-reparation. Nyckeln för att lyckas med denna metod var att skapa en lätt transfectable cellinje, såsom HeLa med rekombination substrat i arvsmassan så att vi får mycket höga halter av GFP konvertering. Vi hade skärmade flera kloner av den ursprungliga omvandling för att få en som inte hade någon påvisbar signal bakgrund GFP, utan på transfektion I-SCEI uttryck plasmid hade en mycket hög nivå av GFP konvertering.
Med denna metod undersöker vi nu andra specifika BRCA1 aminosyror för funktion i homolog rekombination. Tillsammans med biologiska insikter från detta arbete, kan dessa slutsatser tillämpas på Clinical Cancer genetik. En stor andel av generna BRCA1 missense mutationer har okända klinisk betydelse eftersom det finns många sällsynta varianter och det finns otillräcklig information för många av dessa för att bestämma cancer föreningen genom genetisk segregering analys 3,10,13,14. Med denna metod kan konsekvenserna av en specifik variant på den biologiska funktionen hos BRCA1 i regleringen av homolog rekombination användas för att informera kvinnor som bär en av dessa varianter i sin arvsmassa.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma till Ohio State University Comprehensive Cancer Center för att tillhandahålla finansiering för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
