Summary
نحن نقدم طريقة لاختبار المتغيرات BRCA1 في نسيج ثقافة تستند مقايسة لإصلاح تأشب مثلي الحمض النووي من التلف من خلال استنفاد الذاتية البروتين BRCA1 من خلية باستخدام رني واستبدالها متحولة نقطة BRCA1 الذي يحتوي على تغيير الترميز.
Abstract
يمكن أن يكون معقدا في التحليل الوظيفي من الطفرات مغلطة من وجودها في الخلية من البروتين الذاتية. وتعقدت البنية الدالة تحليلات لBRCA1 من عدم وجود تجربة قوية للبروتين الكامل وطول BRCA1 الصعوبات الكامنة في العمل مع خطوط الخلايا التي تعبر عن البروتين hypomorphic BRCA1 1،2،3،4،5. وضعنا نظاما كان المنضب حاد البروتين BRCA1 الذاتية في خلية بواسطة رني استهداف 3' - UTR من BRCA1 مرنا وحلت محلها التعاون transfecting البلازميد معربا عن متغير BRCA1. ميزة واحدة من هذا الإجراء هو أن إسكات الحادة والمتزامنة استبدال BRCA1 تسمح للخلايا أن تنمو من دون طفرات الثانوية أو التعديلات التي قد تنشأ مع مرور الوقت للتعويض عن فقدان وظيفة BRCA1. وقد تم هذا النزف الداخلي وإضافة الى الوراء في خط الخلايا المشتقة من هيلا أن يعاير بسهولة لنشاط إعادة التركيب مثلي. يستند مقايسة تأشب مثلي على طريقة نشرها مسبقا حيث يتم إعادة التركيب المتكامل ركيزة في جينوم (الشكل 1) 6،7،8،9. هذه الركيزة إعادة التركيب يحتوي على انزيم القطع النادرة تقييد I - SCEI موقع داخل أليل GFP نشط ، والمصب الثاني أليل GFP نشط. ترنسفكأيشن من البلازميد التي تعبر عن I - SCEI النتائج في كسر مزدوج الجديلة ، والتي يمكن اصلاحها من خلال إعادة التركيب مثلي ، وإذا كان مثلي لا تأشب إصلاح كسر يخلق أليل GFP النشط الذي سجل بسهولة التدفق الخلوي للتعبير البروتين GFP . أدى استنزاف BRCA1 المحلية في الحد من 8-10 أضعاف في نشاط إعادة التركيب مثلي ، وإضافة الى الوراء البرية من نوع البلازميد الدالة تأشب استعادة كامل مثلي. عندما أعرب عن المسوخ نقطة محددة من BRCA1 طول الكامل من شارك في transfected البلازميدات ، يمكن سجل تأثير متحولة مغلطة محددة. كمثال على ذلك ، أعرب عن التعبير عن بروتين (M18T) BRCA1 ، وهو البديل من الأهمية السريرية غير معروفة 10 ، في هذه الخلايا ، إلا أنها أخفقت في استعادة BRCA1 التي تعتمد على إعادة التركيب مثلي. بواسطة التعبير ، وعلى النقيض من متغير آخر ، وهو أيضا من أهمية مجهولة ، BRCA1 (I21V) استعادة تامة BRCA1 التي تعتمد على وظيفة إعادة التركيب مثلي. وقد تم تطبيق هذه الاستراتيجية لاختبار وظيفة الطفرات BRCA1 مغلطة إلى نظام آخر للمعايرة وظيفة بيولوجية الجسيم المركزي (قيس وآخرون ، والملاحظات غير منشورة). عموما ، فإن هذا النهج هو مناسبة لتحليل المسوخ مغلطة في أي الجينات التي يجب تحليلها مقهور.
Protocol
1. الخط الخلوي مع الركيزة التوحد المتكاملة
- تحولت ستابلي الخلايا هيلا مع PDR - GFP (7 البلازميد هدية من Jasin M. ، ميموريال سلون كيترينج للسرطان) والاحتفاظ بها في بوروميسين لاختيار transformants.
- وpassaged الخلايا في DMEM / FBS ، تحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني ، 2 مم GlutaMAX ، 1 البيروفات الصوديوم مم ، البنسلين / ستربتوميسين (100 U / mL/0.1 ملغ / مل) ، و 1.5 ميكروغرام بوروميسين / مليلتر.
الركيزة إعادة التركيب في GFP - PDR البلازميد ، وtransformants مستقرة ، ويحتوي على اثنين من الأليلات نشط GFP (الشكل 1). أليل واحد غير نشطة نظرا لإدراجها في سلسلتها ترميز تقييد غليان 18 موقع لانزيم الاعتراف SCEI - I. التعبير عن I - SCEI في هذه الخلايا بإنشاء كسر الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (DSB). هناك أليل الثاني من GFP نشط في هذا الحمض النووي ، ولكن جزء من تسلسل لها ارتباط مع موقع I - SCEI على أليل الأول هو من النوع البري. وهذا يمكن أن أليل GFP second بمثابة تسلسل المانحة لإعادة التركيب مثلي إصلاح جهاز تسوية المنازعات ، وسوف ينتج الأليل GFP النشطة ، والتي تم الكشف بسهولة عن طريق التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يمكن اصلاحها جهاز تسوية المنازعات عن طريق امتماثلان نهاية الانضمام ، التي من شأنها أن تدمر موقع تقييد I - SCEI وسيؤدي في GFP سلبية الخلايا. يتم تحديد مستوى من إعادة التركيب مثلي في خلية عن طريق حساب النسبة المئوية للGFP إيجابية الخلايا.
وقد تم اختيار هذا الخط الخلية ، pHeLa DR13 - 9 - ، من بين جميع الحيوانات المستنسخة لصفر خلفية إشارة GFP ونسبة عالية نسبيا من الخلايا GFP إيجابية على ترنسفكأيشن مع I - SCEI معربا عن البلازميد ، pCBASce. (تم تزويد كل من pCBASce وسيطرتها النواقل ، pCAGGS ، بواسطة M. Jasin من مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان).
خط هيلا DR13 - 9 - الخلية هو متاح من الكتاب بناء على الطلب.
2. ترنسفكأيشن المستنفدة لBRCA1 الذاتية وإضافة عودة BRCA1 المسخ.
- قبل يوم من ترنسفكأيشن الأولى (عادة الثلاثاء) : تبدأ مع صحن 10 سم من هيلا DR13 - 9 - متموجة لا يقل عن 90 ٪ الخلايا.
- يعرض للتريبسين في 1 مل ووقف رد الفعل بإضافة 9 مل DMEM / FBS ، ومزيج جيد من قبل pipetting.
- إضافة 40 ميكرولتر من الخلايا trypsinized لكل بئر من 24 لوحة جيدا في 0.5 مل من بورصة دبي للطاقة / FBS.
- اليوم 1 transfections (الأربعاء) : يجب أن تكون الخلايا ~ متموجة 40-50 ٪ ، وإن كانت أقل بكثير البدء من جديد. Transfect عن طريق المزج : 5 سيرنا بمول + 0.3 ميكروغرام BRCA1 - متحولة معربا عن الحمض النووي البلازميد في 12.5 ميكرولتر OPTI - MEM ؛ و 0.5 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 12.5 ميكرولتر OPTI - MEM. المضي قدما في ترنسفكأيشن وفقا لبروتوكول Lipofectamine (Invitrogen).
- استبدال 4-6 ساعات وسائل الاعلام في وقت لاحق. يستند سيرنا نستخدمها لاستنزاف BRCA1 على تحديد تسلسل GCUCCUCUCACUCUUCAGU BRCA1 3' UTR - 80780 إلى 80798 متواليات (انضمام عدد AY273801).
- اليوم 2 : نقل الخلايا trypsinizing من لوحة البئر 24 إلى لوحة 6 جيدا.
- اليوم 3 transfections : 25 سيرنا بمول + 0.75 ميكروغرام BRCA1 ، معربا عن متحولة DNA البلازميد + 0.75 ميكروغرام pCBASce (أو pCAGGS مكافحة ناقلات) 62.5 في ميكرولتر OPTI - MEM و 2.5 ميكرولتر Lipofectamine 2000 في 62.5 ميكرولتر OPTI - MEM. استبدال 4-6 ساعات وسائل الاعلام في وقت لاحق.
3. تحليل Transfectants.
- في يوم 6 ، يعرض للتريبسين الخلايا من كل بئر ووقف في DMEM مل 1 / FBS. يمكن تحليل الخلايا للتعبير GFP يمكن القيام به على 5 أو 7 أيام ، لكننا نجد في ذلك اليوم 6 يعمل بشكل أفضل.
- 10000 تحليل الخلايا بشكل جيد من قبل في التدفق الخلوي. نستخدم أداة بيكتون ديكنسون FACSCalibur في جامعة ولاية أوهايو الشامل للسرطان مركز الموارد التحليلية المشتركة الخلوي. واحدة ، هي بوابات الخلايا الحية باستخدام المعلمات مبعثر إلى الأمام والجانب. تم الكشف عن GFP إيجابية الخلايا باستخدام كاشف مضان GFP (FL1) ، وتعرض النتائج على النحو الرسم البياني (الشكل 2 ، أسفل).
- يمكن replated خلفها الخلايا بواسطة المجهر للتصوير الفوتوغرافي مضان إذا رغبت في ذلك.
4. ممثل النتائج :
BRCA1 ينظم الطريق لإصلاح الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فواصل تأشب مثلي 6،11. يتم الكشف عنها بسهولة تلك الخلايا التي خضعت لإعادة التركيب من خلال إصلاح مثلي بواسطة المجهر مضان (الشكل 2 ، وأعلى). نضوب BRCA1 النتائج إلى انخفاض في GFP إيجابية الكشف عن الخلايا (الشكل 2 ، يمين). الإخراج من FACSCalibur هو الرسم البياني مع كثافة GFP لكل خلية على المحور X وعدد من الخلايا على المحور Y (الشكل 2 ، أسفل). في مجموعة نموذجية من النتائج من تجربة واحدة ، وكان 15.5 ٪ من الخلايا GFP - I - ايجابية بعد SCEI التعبير والرقابة رني استنفاد (الشكل 3). بالمقارنة ، إضافة خفض استنزاف BRCA1 وناقلات الظهر GFP تحويل إلى 0.7 ٪. إضافة الى الوراء البرية من نوع BRCA1 أو BRCA1 (I21V) تأشب استعادة مثلي تماما ، كما كشف عن طريق الحصول على 15-16 ٪ GFP إيجابية الخلايا. إضافة الى الوراء من M1 (BRCA1وكان 8T) متحولة (الشكل 3 ، لين 5) الأثر المماثل كما ظهر الإضافة من مكافحة النواقل. لأن هذا البديل وأعرب عند مستويات مماثلة لهذا البروتين الذاتية 9 ، وبالتالي لنا أن نفسر (M18T) BRCA1 البديل هو غير وظيفية في إعادة التركيب مثلي.
لدينا عادة 10-20 ٪ من الخلايا لتحويل GFP إيجابية بعد transfecting التعبير I - SCEI البلازميد. نضوب BRCA1 يقلل بتكاثر تحويل GFP إيجابية الخلايا بنحو 80-10 ضعفا. على الرغم من أن النسب الفعلية لGFP إيجابية الخلايا قد تتغير من تجربة لتجربة ، فإن نسبة GFP إيجابية الخلايا التالية استنفاد BRCA1 النسبي لاستنزاف السيطرة داخل تجربة متناسقة تماما. نحن تطبيع النتائج من خلال تحديد سعر التحويل غير مأهولة إلى 100 ٪ ، وأعرب عن النتائج مع استنفاد BRCA1 وإضافة ظهورهم ، كنسب مئوية. بهذه الطريقة ، يمكننا الجمع بين التجارب المتعددة ، والاختلاف التجريبية ليست عالية.
إضافة الخلفي من المسوخ BRCA1 حتى الآن أسفرت عن نتائج قوية : كل متغير BRCA1 إما استعادة النشاط الكامل مثلي إعادة التركيب أو لم يكن لها أي تأثير. وهو عامل مهم في الحصول على هذه النتائج هو أن الظروف ترنسفكأيشن لدينا انتاج مستويات البروتين BRCA1 التي متساوية تقريبا تركيز هذا البروتين في الخلايا غير المعالجة الذاتية. قد عالية جدا من overexpression من متحولة ولو عيب من BRCA1 نتيجة ايجابية في بعض النشاط تأشب مثلي.
وهناك مشكلة أننا بحاجة للتغلب على سمية ترنسفكأيشن. يمكن استنفاد BRCA1 بطء نمو الخلايا نفسها ، ويجب أن يعقد على توازن الحمض النووي Lipofectamine - 2000 والبلازميد النسبي لعدد من الخلايا في الطبق عند مستوى ثابت. والحمض النووي للغاية Lipofectamine البلازميد كثيرا أو خفض عدد الخلايا ، وعدد من الخلايا لن تكون كافية للحصول على نتائج موثوقة التدفق الخلوي. رصيد الكواشف البلازميد وLipofectamine مقابل عدد الخلايا transfected مهم جدا للحفاظ على سلامة الخلايا.
الشكل 1. الركيزة إعادة التركيب. وصفت الاستراتيجية التي تم وضعها من قبل مجموعة من Jasin 7،12 م. وPDR - GFP البلازميد يحتوي على اثنين من GFP الأليلات المعيبة ، واحد منها يحتوي على نوكلياز داخلية تقييد I - SCEI الموقع. خط هيلا الخلية المستمدة الحمض النووي يحتوي على هذه الركيزة متكاملة في موقع واحد في الجينوم 9 ، ونشط في إصلاح الحمض النووي كسر المزدوج تقطعت بهم السبل في موقع I - SCEI إعادة التركيب من خلال النتائج متماثلة في تحويل واحد أليل لGFP إيجابية.
الشكل 2. الكشف عن GFP إيجابية الخلايا بواسطة المجهر مضان. تم اختبار الخلايا كما في هذا البروتوكول ، وضبط خلايا المنضب كانت نشطة في إعادة التركيب مثلي ، على النحو الذي كشف على نسبة عالية من الخلايا مع التعبير GFP (يسار). نضوب BRCA1 بواسطة رني النتائج إلى انخفاض حاد في عدد GFP إيجابية الخلايا (يمين).
الشكل 3. النتائج من الظهير إضافة مغلطة BRCA1 من المسوخ. وتظهر النتائج من تجربة واحدة في هذا الرسم البياني. في غياب transfected I - SCEI معربا عن البلازميد (حارة 1) عدم وجود خلايا GFP إيجابية الكشف عنها. وقد اتخذت جميع النتائج في الممرات 2-6 من الخلايا التي تم transfected في I - SCEI معربا عن البلازميد في اليوم 3. في الخلايا التي تم استنفاد عن جين ذي صلة (luciferase) وناقلات مع إضافة الى الوراء ، و 15.5 ٪ من الخلايا كانت إيجابية GFP (حارة 2). نضوب BRCA1 وناقلات إضافة الظهير يكشف عن تأثير فقدان BRCA1 على إعادة التركيب مثلي (حارة 3). وتظهر آثار استنفاد BRCA1 وإضافة الى الوراء البرية من نوع BRCA1 (حارة 4) ، BRCA1 (M18T) (حارة 5) ، وBRCA1 (I21V) (حارة 6). هذه النتائج هي من تجربة واحدة ، وسيكون جنبا إلى جنب مع اثنين على الاقل من التجارب أكثر تكرار من أجل الحصول على قدر من إعادة التركيب مثلي مدعومة البروتين الطافر BRCA1 معين.
Discussion
ميزة هذه الطريقة هو أن نتمكن من دراسة وظيفة البروتين BRCA1 في تنظيم إصلاح الحمض النووي من قبل إعادة التركيب مثلي باستخدام الخلايا التي تحتوي على التطور الطبيعي من النوع البري BRCA1 التي أعرب عنها. اعتمدنا منفصلين الوسائل المتبعة في دراسة عملية إعادة التركيب مثلي والاستفادة من رني بوساطة استنزاف للحصول على طريقة جديدة لاختبار المتغيرات BRCA1 لوظيفة في إصلاح الحمض النووي. وكان المفتاح لنجاح هذا الأسلوب لإنشاء خط خلية transfectable بسهولة ، مثل هيلا ، مع الركيزة إعادة التركيب في الجينوم بحيث نحصل على مستويات عالية جدا من تحويل GFP. كان لدينا فحص الحيوانات المستنسخة متعددة من التحول الأصلي من أجل الحصول على احد ان لم يكن GFP خلفية اكتشاف الإشارات ، ولكن عند ترنسفكأيشن للتعبير I - SCEI البلازميد كان على مستوى عال جدا من تحويل GFP.
مع هذا الأسلوب ، نحن نحقق الآن محددة أخرى BRCA1 مخلفات الأحماض الأمينية وظيفة في إعادة التركيب مثلي. جنبا إلى جنب مع رؤى البيولوجية من هذا العمل ، يمكن تطبيق هذه النتائج إلى علم الوراثة السرطان السريرية. وهناك نسبة عالية من الطفرات BRCA1 مغلطة لها أهمية سريرية غير معروف لأن هناك متغيرات كثيرة ونادرة لا توجد معلومات كافية عن العديد من هذه الجمعيات لتحديد سرطان بواسطة التحليل الجيني 3،10،13،14 العزل. باستخدام هذا الأسلوب ، يمكن أن تستخدم نتائج متغير معين على الوظيفة البيولوجية في تنظيم BRCA1 من إعادة التركيب مماثل لإعلام النساء الذين يحملون واحدة من هذه المتغيرات في الجينوم الخاصة بهم.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون لمركز جامعة ولاية أوهايو الشامل للسرطان لتوفير التمويل اللازم لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
