Summary
Forniamo un metodo per testare le varianti BRCA1 in un test di coltura di tessuti a base di ricombinazione omologa la riparazione del danno al DNA mediante deplezione delle proteine endogene BRCA1 da una cella con RNAi e la sua sostituzione con un mutante punto BRCA1 che contiene un cambio di codifica.
Abstract
L'analisi funzionale di mutazioni missense può essere complicata dalla presenza nella cellula della proteina endogena. Struttura-funzione di analisi del BRCA1 sono state complicate dalla mancanza di un test affidabile per la proteina BRCA1 pieno lunghezza e le difficoltà insite nel lavoro con linee cellulari che esprimono proteine BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. Abbiamo sviluppato un sistema in cui la proteina BRCA1 endogena in una cella è stato acutamente impoverito da RNAi intese a promuovere l'3'-UTR del mRNA BRCA1 e sostituito da co-trasfezione un plasmide che esprime una variante del gene BRCA1. Un vantaggio di questa procedura è che il silenzio acuto di sostituzione BRCA1 e simultanea permettono alle cellule di crescere senza mutazioni secondarie o adattamenti che potrebbero sorgere nel corso del tempo per compensare la perdita della funzione del gene BRCA1. Questo impoverimento e add-back procedura è stata fatta in un HeLa derivate linea cellulare che è stato prontamente analizzati per attività di ricombinazione omologa. La ricombinazione omologa test si basa su un metodo precedentemente pubblicato con il quale è integrato un substrato ricombinazione nel genoma (Figura 1), 6,7,8,9. Questo substrato ricombinazione ha il raro taglio I-SCEI sito enzima di restrizione all'interno di un allele inattivo GFP, ed è a valle un allele secondo GFP inattivo. Trasfezione del plasmide che esprime I-SCEI si traduce in un doppio filamento pausa, che può essere riparato per ricombinazione omologa, e se ricombinazione omologa fa riparare la rottura che crea un allele attivo GFP che è prontamente segnato mediante citometria di flusso per l'espressione della proteina GFP . L'esaurimento delle BRCA1 endogena comportato un 8-10-fold riduzione dell'attività ricombinazione omologa, e aggiungere-back di tipo selvaggio funzione plasmide ricombinazione omologa completamente restaurato. Quando mutanti specifico punto di BRCA1 lunghezza sono stati espressi dal co-trasfettate plasmidi, l'effetto della mutazione missense specifico potrebbe essere segnato. A titolo di esempio, l'espressione della (M18T) proteina BRCA1, una variante di significato clinico sconosciuto 10, è stato espresso in queste cellule, non è riuscito a ripristinare BRCA1-dipendente ricombinazione omologa. Al contrario, espressione di un'altra variante, anche di significato sconosciuto, BRCA1 (I21V) completamente restaurato BRCA1-dipendente funzione di ricombinazione omologa. Questa strategia di test della funzione di BRCA1 mutazioni missense è stato applicato a un altro sistema biologico dosaggio per la funzione centrosoma (Kais et al, osservazioni non pubblicate). Nel complesso, questo approccio è adatto per l'analisi dei mutanti missense in qualsiasi gene che deve essere analizzato recessiva.
Protocol
1. Linea cella con un substrato ricombinazione integrato
- Le cellule HeLa sono state trasformate stabilmente con PDR-GFP (plasmide 7 dono di M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) e mantenuti in puromicina per la selezione dei trasformanti.
- Le cellule sono diversi passaggi in DMEM / FBS, contenente 10% siero fetale bovino, 2 mM GlutaMAX, 1 mM sodio piruvato, penicillina / streptomicina (100 U / mL/0.1 mg / mL), e 1,5 ug / mL puromicina.
Il substrato ricombinazione del PDR-GFP plasmide, e in trasformanti stabili, contiene due alleli inattivi di GFP (Figura 1). Un allele è inattivo a causa dell'inclusione nella sua sequenza codificante del sito di riconoscimento degli enzimi di restrizione 18 bp per I-SCEI. Espressione di I-SCEI in queste cellule crea un doppio filamento rottura del DNA (DSB). C'è un secondo allele di GFP inattivi su questo DNA, ma la parte della sua sequenza correlata con la I-SCEI sito sul allele prima wild-type. Questo allele GFP secondo può funzionare come un donatore sequenza per ricombinazione omologa la riparazione del DSB e si tradurrebbe in un allele GFP attivo, che è prontamente rilevata mediante citometria di flusso. In alternativa, il DSB possono essere riparati con nonhomologous fine-adesione, che avrebbe distrutto l'I-SCEI sito di restrizione e si tradurrebbe in negativo GFP-cellule. Il livello di ricombinazione omologa in una cella è determinato dal conteggio della percentuale di cellule GFP-positive.
Questa linea cellulare, pHeLa-DR13-9, è stato selezionato tra tutti i cloni per lo zero segnale di fondo GFP e una percentuale relativamente elevata di cellule GFP-positive sulla trasfezione con l'I-SCEI esprimendo plasmide, pCBASce. (Il pCBASce e il suo controllo vettoriale, pCAGGS, sono stati entrambi forniti da M. Jasin del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.)
La linea HeLa-DR13-9 celle è disponibile presso gli autori su richiesta.
2. Trasfezione di impoveriscono BRCA1 endogena e Aggiungi Indietro BRCA1 Mutant.
- Il giorno prima della trasfezione prima (di solito un Martedì): Iniziare con un piatto di 10 cm di HeLa-DR13-9 celle di almeno il 90% confluenti.
- Trypsinize in 1 ml e interrompere la reazione con l'aggiunta di 9 ml DMEM / FBS, mescolare bene nel pipettaggio.
- Aggiungere 40 ml di cellule trypsinized per pozzetto di una piastra ben 24 in 0,5 ml di DME / FBS.
- Giorno 1 trasfezioni (Mercoledì): le cellule devono essere confluenti ~ 40-50%, molto meno se ricominciare da capo. Trasfezione mescolando: 5 siRNA pmol + 0,3 ug BRCA1-mutante che esprime DNA plasmidico in 12,5 microlitri Opti-MEM, e 0,5 microlitri Lipofectamine 2000 a 12,5 microlitri Opti-MEM. Procedere con la transfezione secondo il protocollo Lipofectamine (Invitrogen).
- Sostituire le 4-6 ore dei media dopo. L'siRNA che utilizziamo per esaurire BRCA1 si basa sul GCUCCUCUCACUCUUCAGU sequenza specificando BRCA1 3'-UTR sequenze 80.780 a 80.798 (adesione numero AY273801).
- Giorno 2: Trasferire le cellule trypsinizing dalla piastra 24 bene a un piatto ben 6.
- 3 ° giorno trasfezioni: 25 siRNA pmol + 0,75 ug BRCA1-mutante che esprime DNA plasmidico + 0,75 pCBASce ug (o pCAGGS controllo vettoriale) a 62,5 microlitri Opti-MEM e 2,5 microlitri Lipofectamine 2000 a 62,5 microlitri Opti-MEM. Sostituire le 4-6 ore dei media dopo.
3. Analisi dei trasfettate.
- Il giorno 6, trypsinize cellule di ogni pozzetto e fermare in 1 ml di DMEM / FBS. Analizzando le cellule per l'espressione GFP può essere effettuata nei giorni 5 o 7, ma a nostro parere giorno 6 funziona meglio.
- Analizzare 10.000 cellule per pozzetto mediante citometria di flusso. Usiamo un Becton Dickinson strumento FACSCalibur in Ohio State University Comprehensive Cancer Center Citometria analitica risorsa condivisa. Singolo, cellule vive sono gated utilizzando i parametri scatter in avanti e laterale. GFP-positive le cellule vengono rilevati tramite il rilevatore GFP fluorescenza (FL1), ed i risultati sono presentati come un istogramma (figura 2, in basso).
- Sinistra su cellule possono essere saltuariamente per la fotografia al microscopio a fluorescenza, se desiderato.
4. Rappresentante dei risultati:
BRCA1 regola il percorso per la riparazione delle doppie rotture del DNA bloccati dalla ricombinazione omologa 6,11. Quelle cellule che hanno subito la riparazione per ricombinazione omologa sono prontamente rilevate al microscopio a fluorescenza (Figura 2, in alto). Esaurimento dei risultati BRCA1 in una diminuzione della GFP-positive rilevate cellule (Figura 2, a destra). L'output del FACSCalibur è un istogramma con intensità GFP per cella sul asse X e il numero di celle dell'asse Y (Figura 2, in basso). In un tipico insieme di risultati di un singolo esperimento, il 15,5% delle cellule sono state GFP-positive dopo la I-SCEI espressione e di controllo esaurimento RNAi (Figura 3). In confronto, l'esaurimento di BRCA1 e vettore aggiungere di nuovo ridotto GFP-conversione al 0,7%. Add-back di tipo selvaggio BRCA1 o di BRCA1 (I21V) completamente restaurato ricombinazione omologa, come rilevato da ottenere 15-16% delle cellule GFP-positive. Add-posteriore del (BRCA1 M18T) mutante (Figura 3, corsia 5) ha avuto un effetto simile a quello della reintegrazione del controllo vettoriale. Dato che questa variante espressa a livelli simili a quelli della proteina endogena 9, abbiamo quindi interpretare le (M18T) BRCA1 variante non è funzionale a ricombinazione omologa.
Noi in genere hanno il 10-20% delle cellule convertire GFP-positive dopo la trasfezione I-SCEI plasmide di espressione. L'esaurimento delle BRCA1 riduce riproducibile la conversione di cellule GFP-positive di circa 8-10 volte. Anche se le percentuali effettive di GFP-positive cellule possono cambiare da esperimento per esperimento, il rapporto tra le cellule GFP-positive a seguito di esaurimento BRCA1 rispetto al depauperamento controllo all'interno di un esperimento è del tutto coerente. Noi normalizzare i risultati impostando il tasso di conversione disinibita al 100% e risultati esprimono con svuotamenti BRCA1 e aggiungere-backs come percentuali. In questo modo, siamo in grado di combinare molteplici esperimenti, e la variazione sperimentale non è elevato.
Aggiungere nuovamente di mutanti BRCA1 hanno finora dato risultati robusti: ogni variante BRCA1 o ha completamente restaurato ricombinazione omologa attività o ha avuto alcun effetto. Una considerazione importante per ottenere questi risultati è che le nostre condizioni di trasfezione produrre livelli di proteina BRCA1 che approssimativamente uguale alla concentrazione della proteina endogena in cellule non trattate. Troppo alto di una sovraespressione di anche un mutante difettoso di BRCA1 può comportare in alcuni positivi attività ricombinazione omologa.
Un problema che abbiamo dovuto superare è stata la tossicità di trasfezione. L'esaurimento delle BRCA1 si può rallentare la crescita cellulare, e l'equilibrio del DNA Lipofectamine-2000 e plasmide rispetto al numero di celle nel piatto deve essere tenuto ad un livello costante. DNA troppo Lipofectamine o plasmide sarà ridurre il numero delle cellule, e il numero di cellule non sarà sufficiente per ottenere risultati affidabili citometria a flusso. Il saldo dei reagenti plasmide e Lipofectamine rispetto al numero di cellule trasfettate è molto importante per il mantenimento della vitalità delle cellule.
Figura 1. Il substrato ricombinazione. La strategia che era stato sviluppato dal gruppo di M. Jasin 7,12 è raffigurato. Il PDR-GFP plasmide contiene due alleli difettosi di GFP, uno dei quali contiene un I-SCEI sito endonucleasi di restrizione. Un derivato linea cellulare HeLa contiene questo substrato di DNA integrato in un unico sito nel genoma 9, e la riparazione attiva della doppia elica del DNA rompere al I-SCEI sito ricombinazione omologa risultati nella conversione di un allele di GFP-positive.
Figura 2. Rilevamento di GFP-positive le cellule al microscopio a fluorescenza. Le cellule sono state testate di cui al presente protocollo e di controllo impoverito le cellule erano attivi in ricombinazione omologa, come rilevato da un'alta percentuale di cellule con espressione di GFP (a sinistra). L'esaurimento delle BRCA1 dai risultati RNAi in una forte riduzione del numero di cellule GFP-positive (a destra).
Figura 3. I risultati di un add-back di mutanti missense BRCA1. I risultati di un singolo esperimento sono riportati in questo istogramma. In assenza di transfettate I-SCEI esprimendo plasmide (corsia 1) non ci sono cellule GFP-positive rilevate. I risultati in corsie 2-6 sono stati tutti presi dalle cellule in cui è stato transfettate I-SCEI plasmide che esprime al giorno 3. Nelle cellule che sono state esaurite per un gene irrilevante (luciferasi) e con vettore aggiungere-back, il 15,5% delle cellule sono state GFP-positive (corsia 2). L'esaurimento delle BRCA1 e vettore di add-back rivela l'effetto della perdita di BRCA1 sulla ricombinazione omologa (corsia 3). Gli effetti di impoverimento delle BRCA1 e add-retro di wild-type BRCA1 (corsia 4), BRCA1 (M18T) (corsia 5), e BRCA1 (I21V) (corsia 6) sono mostrati. Questi risultati provengono da un singolo esperimento, e potrebbe essere combinata con almeno due esperimenti ripetere più al fine di ottenere una misura della ricombinazione omologa supportata da una data proteina BRCA1 mutato.
Discussion
Il vantaggio di questo metodo è che possiamo studiare la funzione della proteina BRCA1 nella regolazione della riparazione del DNA per ricombinazione omologa utilizzando cellule che hanno wild-type BRCA1 endogenamente espresso. Abbiamo adottato due metodi distinti costituiti di studiare il processo di ricombinazione omologa e di utilizzare l'RNAi mediato esaurimento per ottenere il nuovo metodo per il test per la funzione varianti BRCA1 nella riparazione del DNA. La chiave per il successo di questo metodo è stato quello di stabilire una linea di cellule facilmente transfectable, come ad esempio HeLa, con il substrato ricombinazione del genoma in modo tale che si ottengono livelli molto alti di conversione GFP. Avevamo proiettato più cloni della trasformazione originale al fine di ottenere uno che non aveva segnale rilevabile GFP fondo, ma dopo trasfezione delle I-SCEI plasmide di espressione aveva un livello molto elevato di conversione GFP.
Con questo metodo, ora stiamo studiando altri specifici residui di aminoacidi BRCA1 per la funzione di ricombinazione omologa. Insieme con la intuizioni biologico da questo lavoro, queste conclusioni possono essere applicate alla genetica clinica sul cancro. Un'alta percentuale di BRCA1 mutazioni missense sono sconosciute significato clinico poiché ci sono molte varianti rare e non ci sono informazioni sufficienti per molte di queste per determinare l'associazione del cancro attraverso l'analisi di segregazione genetica 3,10,13,14. Utilizzando questo metodo, le conseguenze di una variante specifica per la funzione biologica di BRCA1 nella regolazione della ricombinazione omologa potrebbero essere utilizzati per informare le donne che svolgono una di queste varianti nel loro genoma.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Siamo grati allo Stato dell'Ohio Centro Comprehensive Cancer dell'Università per il finanziamento per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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