Summary
우리는 RNAi를 사용하여 세포의 내생 BRCA1 단백질을 파괴하고 코딩 변경을 포함하는 BRCA1 포인트 돌연변로 대체하여 DNA 손상의 동종 재조합의 수리를 위해 조직 문화를 기반으로 분석에서 BRCA1 변종을 테스트하기위한 방법을 제공합니다.
Abstract
missense 변이의 기능 분석은 내생 단백질의 세포에 존재에 의해 복잡하실 수 있습니다. BRCA1의 구조 기능 분석은 전체 길이 BRCA1 단백질과 hypomorphic BRCA1 단백질 1,2,3,4,5을 표현하는 세포 라인 작업 고유의 문제에 대한 강력한 분석의 부족에 의해 복잡하고 있습니다. 우리는 세포의 내생 BRCA1 단백질이 심하게 BRCA1의 mRNA의 3' - UTR을 대상으로 RNAi에 의해 고갈 및 BRCA1의 변형을 표현하는 플라스미드를 공동 transfecting으로 대체되었습니다 약자 시스템을 개발했습니다. 이 절차의 장점 중 하나는 BRCA1과 동시 교체의 급성 입을은 세포가 보조 돌연변이 BRCA1 또는 기능의 손실을 보상하기 위해 시간이 지남에 따라 발생할 수 adaptations없이 성장할 수 있도록한다는 것입니다. 이 고갈 및 추가 기능 다시 절차는 즉시 동종 재조합의 활동에 assayed되었습니다 헬라 유도 세포 라인에서 이루어졌다. 상동 재조합 분석은 재조합 기판은 게놈 (그림 1) 6,7,8,9에 통합되어 의하여 이전에 게시된 방법에 따라 달라집니다. 이 재조합 기판은 비활성 GFP allele의 내부 드문 절감 I - SceI 제한 효소 사이트를 가지고 있으며, 하류 두 번째 비활성 GFP의 allele입니다. 상동 재조합에 의해 수리 수있는 두 번 좌초 휴식에 I - SceI 결과를 표현하고, 상동 재조합은 휴식을 수리 않은 경우는 즉시 GFP 단백질의 표현 유동세포계측법에 의해 채점되어 활성 GFP의 allele를 생성하는 플라스미드의 Transfection . 내생 BRCA1의 고갈은 상동 재조합 활동에 8 - 10 - 배 감소하고, 추가 기능 다시 야생 형 플라스미드 완전 상동 재조합 복원 기능의. 전체 길이 BRCA1의 특정 지점 돌연변이 공동 transfected plasmids에서 표현되었을 때, 특정 missense의 돌연변이의 효과가 득점 수 있습니다. 예를 들어, BRCA1 (M18T) 단백질, 알 수없는 임상 중요성 10 변종의 표현이 이러한 세포로 표현되었다, 그것은 BRCA1 종속 상동 재조합을 복원하지 못했습니다. 또한 알 수없는 의미의 또 다른 변종의 명암, 표현에 의해, BRCA1은 (I21V) 완전 BRCA1에 의존 상동 재조합 기능을 복원. BRCA1 missense 변이의 기능을 테스트의이 전략은 centrosome 기능 (Kais 외, 관찰되지 않은)에 시금 다른 생물 학적 시스템에 적용되었습니다. 전반적으로, 이러한 방식은 recessively 분석해야하는 유전자의 missense의 돌연변이의 분석에 적합합니다.
Protocol
1. 통합 재조합 기판과 세포주
- 헬라 세포는 안정 PDR - GFP (M. Jasin, 메모 리얼 슬로언 케터링 암 센터에서 플라스미드 7 선물)로 변환하고 transformants 선정을위한 puromycin 유지했다.
- 세포 10% 태아 소 혈청, 2 MM GlutaMAX, 1 MM 나트륨 pyruvate, 페니실린 / 스트렙토 마이신 (100 U / mL/0.1 MG / ML), 그리고 1.5 UG / ML puromycin 포함된 DMEM / FBS에 passaged 있습니다.
플라스미드, 그리고 안정적인 transformants에 PDR - GFP의 재조합 기판은 GFP의 두 대립 유전자 비활성 (그림 1)가 포함되어 있습니다. 한 allele 인해 I - SceI에 대한 18 BP 제한 효소 인식 사이트의 코딩 순서에 포함하는 운영 중지 상태입니다. 이러한 세포에서 I - SceI 표현을 두 번 좌초 DNA의 휴식 (DSB)를 만듭니다. 가이 DNA를 비활성 GFP의 두 번째 allele는하지만, 첫 번째 allele에있는 I - SceI 사이트와 상관의 순서의 부분은 야생 타입입니다. 이 두 번째 GFP의 allele은 DSB의 동종 재조합의 수리를 위해 순서 기증자와 같은 기능을 수 있으며, 쉽게 유동세포계측법에 의해 감지되는 활성 GFP의 allele에 나타날 수 있습니다. 또는, DSB가 nonhomologous I - SceI 제한 사이트를 파괴 될 것이며 GFP - 부정적인 세포가 발생하는 것입니다, 최종 입사하여 수리 수 있습니다. 세포 동종 재조합의 수준은 GFP 양성 세포의 백분율을 계산에 의해 결정됩니다.
이 세포주, pHeLa - DR13 - 9는 제로 배경 GFP 신호와 플라스미드, pCBASce을 표현 I - SceI로 transfection시 GFP 양성 세포의 상대적으로 높은 비율의 모든 클론 중 선정되었습니다. (pCBASce 및 벡터 제어, pCAGGS는 메모 리얼 슬로언 케터링 암 센터의 M. Jasin에 의해 공급되었다 모두.)
헬라 - DR13 - 9 세포주 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다.
2. Transfection은 내생 BRCA1을 고갈 및 뒤로 돌연변이 BRCA1를 추가합니다.
- 첫 번째 transfection (보통 화요일) 전에 하루 : 헬라 - DR13 - 9 세포 최소 90 %의 합류 10cm 요리와 함께 시작합니다.
- 1 ML에 Trypsinize 9 ML DMEM / FBS를 추가하여 반응을 정지, pipetting으로 잘 섞는다.
- trypsinized 세포의 40 μL 당 우물의 DME / FBS 0.5 ML에 24 잘 접시를 추가합니다.
- 1 일 transfections 일 (수) : 훨씬 적은가 다시 시작하면 세포가 ~ 40~50%의 합류해야합니다. 혼합하여 Transfect : 5 pmol의 siRNA + 12.5 μL Opti - 멤에서 플라스미드 DNA을 표현 0.3 UG BRCA1 - 돌연변이 및 12.5 μL Opti - 멤 0.5 μL Lipofectamine 2000. Lipofectamine 프로토콜 (Invitrogen)에 따라 transfection과 함께 진행합니다.
- 나중에 미디어 4~6시간를 교체하십시오. 우리가 BRCA1을 고갈하는 데 사용하는 siRNA는 80,798 (가입 번호 AY273801)로 BRCA1 3' - UTR 시퀀스 80,780을 지정 순서 GCUCCUCUCACUCUUCAGU에 따라 달라집니다.
- 일 2 : 6 잘 접시에 24 잘 접시에서 trypsinizing하여 세포를 전송합니다.
- 3 일 transfections : 25 pmol의 siRNA + 플라스미드 DNA을 표현 0.75 UG BRCA1 돌연변 + - 62.5 μL Opti - 멤와 62.5 μL Opti - 멤 2.5 μL Lipofectamine 2000 년 0.75 UG의 pCBASce (또는 pCAGGS 벡터 제어). 나중에 미디어 4~6시간를 교체하십시오.
3. Transfectants 분석.
- 일 6 각 우물에서 세포를 trypsinize 1 ML DMEM / FBS에서 중지합니다. GFP의 표현에 대한 세포를 분석하는 것은 일 5 7 일을하지만 우리는 6 작품이 최고의 그날을 찾을 수 있습니다.
- 유동세포계측법에 의해 잘 10,000 세포를 분석할 수 있습니다. 우리는 오하이오 주립 대학 종합 암 센터의 분석 Cytometry 공유 자원에 백톤 디킨슨 FACSCalibur기구를 사용합니다. 싱글, 라이브 세포는 앞으로 측면 산란 매개 변수를 사용하여 문이 있습니다. GFP 양성 세포가 GFP 형광 검출기 (FL1)를 사용 감지하며, 결과는 히스토그램 (그림 2 하단)로 제공됩니다.
- 원하는 경우 왼쪽을 통해 세포는 형광 현미경으로 사진에 대한 replated 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
BRCA1은 상동 재조합 6,11에 의해 두 번 좌초 DNA 나누기의 복구에 대한 경로를 규정합니다. 상동 재조합에 의해 수리를받은 이들 세포는 쉽게 형광 현미경 (그림 2 위)에 의해 감지됩니다. 검색된 GFP 양성 세포 (그림 2, 오른쪽)의 감소에서 BRCA1 결과의 고갈. FACSCalibur의 출력은 X 축 및 Y 축 (그림 2 하단)에 세포의 수를 셀 당 GFP 강도와 히스토그램이다. 한 실험에서 결과의 전형적인 설정에서 세포의 15.5 %가 I - SceI 표현 및 제어 RNAi 고갈 (그림 3) 후 GFP 양성했다. 비교함으로써, BRCA1과 벡터의 고갈 다시 0.7 %로 GFP - 전환을 감소 추가할 수 있습니다. 추가 다시 야생 형 BRCA1이나 BRCA1 (I21V) 완벽하게 복원된 동종 재조합의로 15~16% GFP 양성 세포를 얻어 발견했습니다. 추가 다시 BRCA1 (M1의8T) 돌연변이 (그림 3, 레인 5) 벡터 컨트롤의 추가 기능 다시와 유사한 효과를했습니다. 이 변종은 내생 단백질 구와 유사한 수준의 표현부터, 우리는 따라서 BRCA1 (M18T) 변종은 상동 재조합에 비 작동 해석한다.
우리는 일반적으로 I - SceI의 표현이 플라스미드 transfecting 후 GFP 양성으로 전환할 세포의 10~20% 있습니다. BRCA1의 고갈은 reproducibly 80-10 대해 접이식하여 GFP 양성 세포의 전환을 줄일 수 있습니다. GFP 양성 세포의 실제 비율은 실험 내에서 제어 고갈에 비해 BRCA1의 고갈 다음과 같은 실험에서 실험, GFP 양성 세포의 비율을 변경할 수 있지만 것은 상당히 일관성이있다. 우리는 100 %와 백분율로 BRCA1의 depletions과 추가 떠밀렸고 표현 결과에 노골적인 전환율을 설정하여 결과를 정상화. 이러한 방법으로, 우리는 여러 실험을 결합 수 있으며, 실험 유사 높지는 않습니다.
지금까지 강력한 결과를 낮은 다시 BRCA1의 돌연변이의 추가 : 각 BRCA1의 변형도 완전 상동 재조합 활동을 복원되었거나 전혀 아무런 영향을 미치지 않았다 있습니다. 이러한 결과를 얻기에 중요한 고려 사항은 우리 transfection 조건이 약 치료 세포의 내생적인 단백질의 농도를 동일 BRCA1 단백질의 수준을 생산한다는 것입니다. BRCA1의도 결함 돌연변이의 overexpression의 너무 높은 몇 가지 긍정적인 상동 재조합 활동에 발생할 수 있습니다.
우리가 극복한다고 문제가 transfection의 독성했다. BRCA1 자체의 고갈은 세포 성장을 늦출 수 있으며, 접시에 세포의 숫자에 비해 Lipofectamine - 2000 및 플라스미드 DNA의 균형은 지속적인 수준에서 실시되어야합니다. 너무 Lipofectamine 또는 플라스미드 DNA는 세포 숫자를 줄일 것이며, 세포의 숫자는 신뢰할 수있는 유동세포계측법 결과를 얻을 부족합니다. transfected 세포의 수를 비교 플라스미드와 Lipofectamine 시약의 균형은 세포의 생존을 유지하기 위해 매우 중요합니다.
그림 1. 재조합 기판. M. Jasin 7,12의 그룹에 의해 개발되었습니다 전략 그려져 있습니다. 플라스미드 PDR - GFP는 I - SceI 제한 endonuclease 사이트를 포함 하나있는 GFP의 두 대립 유전자 결함을 포함하고 있습니다. 헬라 파생된 세포 선이의 DNA 게놈 9 한 사이트에서 통합 기판, 그리고 GFP 양성 한 allele의 전환이 동종 재조합의 결과에 의해 I - SceI 사이트에서 이중 좌초된 DNA 브레이크의 적극적인 복구가 포함되어 있습니다.
그림 2. 형광 현미경에 의해 GFP 양성 세포 감지. 세포는이 절차에 따라 테스트 및 제어 - 고갈 전지는 GFP 표현 (왼쪽)과 함께 세포의 높은 비율로 검출, 상동 재조합에 적극적으로 하였다. GFP 양성 세포 (오른쪽)의 개수에 날카로운 감소 RNAi 결과로 BRCA1의 고갈.
그림 3. BRCA1의 missense의 돌연변이의 추가 다시 결과. 한 실험에서 결과는 본 막대 그래프에 표시됩니다. 플라스미드을 표현 transfected I - SceI의 부재 (레인 1)에서 감지하지 GFP 양성 세포가 없습니다. 레인스 2-6의 결과는 모든 플라스미드 표현 I - SceI이 일 3 transfected어진 세포에서 찍은. 관련성이없는 유전자 (루시페라제)의 고갈 및 벡터 추가 다시와 세포의 15.5 %가 (레인 2) GFP 양성에 있었 세포. BRCA1 및 벡터의 고갈 추가 - 다시 상동 재조합에 BRCA1의 손실의 효과 (레인 3) 보여준다. BRCA1의 고갈과 추가 다시 야생 타입 BRCA1 (레인 4), BRCA1 (M18T) (레인 5) 및 BRCA1 (I21V) (레인 6)의 효과가 표시됩니다. 이러한 결과는 단일 실험에서, 그리고 특정 돌연변이 BRCA1 단백질 지원하는 동종 재조합의 측정을 얻기 위해서는 적어도 두 번 더 반복 실험과 결합됩니다.
Discussion
이 방법의 장점은 우리가 야생 형 endogenously 표현 BRCA1을 가지고 세포를 사용 상동 재조합에 의해 DNA의 복구를 규제에서 BRCA1 단백질의 기능 연구를 수있다는 것입니다. 우리는 상동 재조합 과정을 공부하고 DNA 수리의 기능을 위해 BRCA1 변종 테스트를위한 소설 방법을 얻기 위해 RNAi - 중재 고갈을 이용한 두 가지 별도의 설립 방식을 채택했습니다. 이 방법의 성공을위한 열쇠는 우리가 GFP 변환의 매우 높은 수준을 얻는 것과 같은 게놈의 재조합 기판과 같은 헬라로 쉽게 transfectable 세포주를 확립하는 것이었다. 우리는 전혀 감지 배경 GFP 신호도 없었을 얻기 위해서는 원래의 변화의 여러 클론을 상영지만, 플라스미드 I - SceI 표현의 transfection에 따라 GFP 변환의 매우 높은 수준을했다했다.
이 방법을 통해, 우리는 이제 동종 재조합의 기능에 대한 다른 구체적인 BRCA1 아미노산 잔류물을 조사하고 있습니다. 이 작품의 생물 학적 통찰력과 함께, 이러한 결론은 임상 암 유전자에 적용할 수 있습니다. 많은 희귀한 변종이 있기 때문에 BRCA1 missense 변이의 높은 비율을 알 수없는 임상 중요성을 가지고 유전자 분리 분석 3,10,13,14하여 암 협회를 결정하기 위해 이들 중 많은 부족한 정보가있다. 이 방법을 사용하여 상동 재조합을 조절에서 BRCA1의 생물 학적 기능의 특정 변형의 결과는 자신의 게놈에서 이러한 변종 중 하나를 수행 여자를 알려하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 작품에 대한 자금 제공을위한 오하이오 주립 대학 종합 암 센터에 감사하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11960 | |
| FBS | USA Scientific, Inc. | 9871-5200 | |
| siRNA | Invitrogen | N/A | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | |
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | |
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | |
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
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