Chromatographie d'affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

Résumé

Pour tester l'interaction d'une protéine avec ses cibles lipidiques nous avons utilisé MACS et l'annexine V conjuguée à des billes magnétiques et les vésicules lipidiques synthétisées à partir des lipides cible et l'annexine V-contraignante phosphatidylsérine. Protéines liées à l'lipidiques cibles sont co-purifiés et analysés après élution à partir des perles.

Résumé

L'analyse des interactions protéine lipidique est difficile parce que les lipides sont incorporés dans les membranes cellulaires et donc inaccessible à la plupart des procédures de purification. Comme alternative, les lipides peuvent être enduits sur des surfaces planes que celles utilisées pour des lipides ELISA et spectroscopie de résonance plasmonique. Cependant, les lipides revêtement de surface ne forment pas des structures microdomaines, qui peut être important pour les propriétés des lipides contraignant. De plus, ces méthodes ne permettent pas pour la purification de grandes quantités de protéines se liant à leurs lipides cible.

Pour surmonter ces limitations des tests d'interaction protéine de lipides et de lipides pour purifier des protéines de liaison, nous avons développé une nouvelle méthode appelée chromatographie d'affinité lipidique des vésicules à médiation à l'aide de tri magnétique de cellules activées (LIMACS). Dans cette méthode, des vésicules lipidiques sont préparées avec les cibles lipidiques et la phosphatidylsérine comme lipide d'ancrage de l'annexine V MACS. Phosphatidylsérine est un phospholipide membranaire cellulaire ubiquitaire qui montre une forte affinité pour l'annexine V. protéines utilisant des billes magnétiques conjuguées à l'annexine V les vésicules lipidiques contenant phosphatidylsérine va se lier à des billes magnétiques. Lorsque les vésicules lipidiques sont incubés avec un lysat cellulaire de la protéine de liaison à l'lipidiques cibles seront également lié aux billes et peuvent être co-purifiée en utilisant MACS. Cette méthode peut également être utilisé pour tester si les protéines recombinantes reconstituer un complexe protéine de liaison à l'lipidiques cibles.

Nous avons utilisé cette méthode pour montrer l'interaction de la PKC atypiques (aPKC) avec le céramide sphingolipides et co-purifient réponse apoptose de la prostate 4 (PAR-4), une protéine de liaison à la céramide-aPKC associés. Nous avons aussi utilisé cette méthode pour la reconstitution d'un complexe céramide-associé de la aPKC recombinant avec la cellule de polarité des protéines liées Par6 et Cdc42. Depuis des vésicules lipidiques peuvent être préparés avec une variété de sphingo ou phospholipides, LIMACS propose un test polyvalent pour interactions lipide-protéine dans un environnement lipidique qui ressemble étroitement à celle de la membrane cellulaire. D'autres complexes protéiques des lipides peuvent être identifiés en utilisant une analyse protéomique de protéines liaison aux lipides co-purifiée avec les vésicules lipidiques.

Protocole

1. Présentation

La chromatographie d'affinité lipidique des vésicules à médiation à l'aide de tri magnétique de cellules activées (LIMACS) technique a été développée dans notre laboratoire afin d'isoler les complexes protéiques associés aux céramides ^1-3. A l'origine, les vésicules lipidiques ont été faites de céramide et de la phosphatidylsérine, qui a permis de MACS en utilisant des particules magnétiques conjuguées à l'annexine V (très affine à la phosphatidylsérine) pour isoler les vésicules et de leurs protéines associées. Nous avons utilisé la technique LIMACS pour la reconstitution in vitro d'un complexe ....

Discussion

Pour tester l'interaction spécifique entre un lipide et sa protéine de liaison est entravée par l'incorporation de lipides dans la membrane cellulaire. La membrane cellulaire est constitué d'un mélange de plusieurs types de lipides et de protéines et il est organisé en microdomaines lipidiques ou radeaux. Par conséquent, la co-purification des microdomaines et les protéines ne peuvent pas distinguer clairement si une protéine se lie directement à un lipide ou est seulement enrichi dans une structure en micro.......

Matériaux

Annexine V conjuguée à des billes magnétiques et MACS micro et minicolonnes ont été fournis par Miltenyi Biotec, Inc (Auburn, Californie). Tous les lipides étaient de plus grande pureté et obtenu de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).