Summary
כדי לבדוק את האינטראקציה של חלבון עם שומנים היעד השתמשנו macs ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים שלפוחית השומנים מסונתז מ השומנים היעד Annexin V-מחייב phosphatidylserine. חלבונים חייב השומנים היעד הם שיתוף מטוהרים ונותחו לאחר elution מן החרוזים.
Abstract
ניתוח של אינטראקציה חלבון שומנים קשה בגלל שומנים המוטבעים קרום התא ולכן נגיש הליכי טיהור ביותר. כחלופה, שומנים יכולים להיות מצופים על משטחים שטוחים כמו משמש השומנים ELISA ו Plasmon ספקטרוסקופיית תהודה. עם זאת, ציפוי משטח שומנים לא יוצרים מבנים microdomain, אשר עשוי להיות חשוב עבור המאפיינים מחייב השומנים. יתר על כן, שיטות אלו אינן מאפשרות לטיהור של כמויות גדולות יותר של חלבונים מחייב שומנים היעד שלהם.
כדי להתגבר על המגבלות האלה של בדיקת חלבון אינטראקציה שומנים לטהר חלבונים מחייב השומנים פיתחנו שיטה חדשה המכונה שלפוחית בתיווך זיקה השומנים באמצעות כרומטוגרפיה המגנטי המופעל מיון תאים (LIMACS). בשיטה זו, שלפוחית השומנים מוכנים עם השומנים היעד phosphatidylserine כמו שומנים עוגן עבור Annexin V MACS. Phosphatidylserine הוא נמצא בכל מקום קרום התא פוספוליפידים המציגה בזיקה גבוהה Annexin החלבון V. שימוש חרוזים מגנטיים מצומדות כדי Annexin V phosphatidylserine המכילים שומנים שלפוחית יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים. כאשר שלפוחית השומנים מודגרת עם תא lysate חלבון מחייב השומנים היעד יהיה גם חייב את החרוזים יכול להיות שותף מטוהרים באמצעות MACS. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לבדוק אם חלבונים רקומביננטי מחדש מורכב חלבון מחייב השומנים היעד.
השתמשנו בשיטה זו כדי להראות את האינטראקציה של PKC טיפוסיות (aPKC) עם ceramide sphingolipid ואת התגובה הערמונית שיתוף לטהר אפופטוזיס 4 (PAR-4), חלבון מחייב aPKC ceramide הקשורים. יש לנו גם השתמשו בשיטה זו בריאורגניזציה של מורכבות ceramide הקשורים של aPKC רקומביננטי עם הקוטביות בתא חלבונים הקשורים Par6 ו Cdc42. מאז שלפוחית השומנים ניתן להכין עם מגוון רחב של sphingo או פוספוליפידים, LIMACS מציע מבחן תכליתי עבור אינטראקציה שומנים החלבון בסביבה השומנים הדומה באופן הדוק לזה של קרום התא. חלבון נוסף מתחמי השומנים ניתן לזהות באמצעות ניתוח proteomics של חלבון שומנים מחייב שיתוף מטוהרים עם שלפוחית השומנים.
Protocol
1. הקדמה
שלפוחית בתיווך זיקה השומנים באמצעות כרומטוגרפיה המגנטי המופעל מיון תאים (LIMACS) הטכניקה פותחה במעבדה שלנו לבודד ceramide הקשורים קומפלקסים חלבונים 1-3. במקור, שלפוחית השומנים היו עשויים ceramide ו phosphatidylserine, שאיפשר MACS באמצעות מגנטי מצומדות החלקיקים Annexin V (המאוחד מאוד phosphatidylserine) כדי לבודד את שלפוחית וחלבונים הקשורים בהם. השתמשנו בטכניקה LIMACS עבור מבחנה ב הכינון מחדש של המתחם ceramide הקשורים הקוטביות ואת הבידוד של ceramide מחייב חלבונים מתא lysates 3. LIMACS ניתן לשנות באמצעות שותפים אינטראקציה אחרת הבידוד של שלפוחית (למשל, glycolipid-ספציפיות לקטינים או שומנים בדם נוגדנים).
2. ניסיוני נהלים
הכנת שלפוחית ליפידים מבחני aPKCBinding
- שלפוחית ליפידים מתקבלים תערובות מיובשים כמויות equimolar של phosphatidylserine (105 מיקרוגרם) ו-C16 ceramide (85 מיקרוגרם) בעקבות ההליכים שונה להכנת liposome גדול 1,4-7.
- תערובות השומנים הם resuspended אז sonicated עבור h 1 ב 100 μl של שלפוחית חיץ המורכב של 50 מ"מ טריס / HCl (pH 7.5) ו 150 mM NaCl.
- לאחר הוספת 300 μl של חיץ שלפוחית בתוספת 0.1 מ"מ MnCl 2, דגימות הן centrifuged ב g μ 12,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- גלולה (שלפוחית השומנים גדול) הוא resuspended ב μl 100 של המאגר ואת שלפוחית מודגרות עם nmol 1 של Vybrant CM-diI עבור h 1 ב 37 ° C כדי להמחיש את השבר שלפוחית לאחר ההפרדה MACS. Vybrant CM-diI הוא צבע פלואורסצנטי אדום במיוחד המשלב לתוך ממברנות שומנים בדם.
- חומרי ניקוי ללא lysate התא הוא הוכן על ידי sonication / homogenization של תאים μl 300 של חיץ hypotonic (10 mM טריס / HCl (pH 7.0) עם מעכבי פרוטאז ו phosphatase) ואחריו סילוק פסולת קרומי ידי צנטריפוגה. צעד צנטריפוגה ב XG 100,000 עבור h 1 יש להוסיף, כדי למנוע זיהום של lysate התא עם ממברנות אנדוגני המכיל phosphatidylserine.
- Lysate פינו מתווסף ההשעיה שלפוחית שומנים בדם, ואת התערובת מודגרות עבור 2 שעות על 4 ° C.
- תערובת התגובה היא בתוספת 20 μl של חיץ 20x V Annexin מחייב 50 μl של תמיסה המכילה חרוזים מגנטיים מצומדות כדי Annexin V ואחריו הדגירה של ח 1 ב 4 ° C.
- MACS נעשה על פי היצרן (Miltenyi BIOTEC, Inc) פרוטוקול. נוכחות וכמות השומנים שלפוחית נקבעת על ידי ניטור הקרינה Vybrant CM-diI של זרימה דרך elution שברים באמצעות קורא הקרינה microplate.
- מתאם ליניארי בין כמות השומנים שלפוחי ועוצמת הקרינה של שלפוחית הנכנס Vybrant CM-diI מאומת על ידי כמותי בעל ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה בשכבה דקה (HPTLC) של תערובת שומנים להחיל Annexin V מבוססי macs.
- הספציפיות של התגובה מחייב של חלבונים aPKC או אחר ceramide / phosphatidylserine שלפוחית מאומת על ידי assay נוגדן התחרות באמצעות 1 מיקרוגרם של נוגדנים נגד PKCζ-ארנב polyclonal כדי לדגור על lysate התא 1 שעות ב 4 ° C לפני הדגירה עם השומנים שלפוחית.
- חלבון מחייב ceramide / phosphatidylserine שלפוחית ב eluate MACS הוא מנותח על ידי-SDS ו immunoblotting.
במתחם שומנים חלבון הקוטביות חוץ גופית
- ב הכינון מחדש חוץ גופית של תסביך שומנים חלבון הקוטביות מתבצע בעקבות ההליך LIMACS כמתואר בסעיף הקודם. בקיצור, phosphatidylserine (420 מיקרוגרם) ו-C16 ceramide (107 מיקרוגרם) הוא מיובש של ממיס אורגני.
- שומנים הם מיובשים resuspended תחת sonication ב 500 μl של חיץ שלפוחית (50 mM טריס / HCl, pH 7.5, 150 מ"מ NaCl).
- חמש μl של 10 מ"מ MnCl2, 1 μl של Vybrant CM-diI, ו 500 ננוגרם של PKCζ (רקומביננטי אנושי) הוא הוסיף את תערובת התגובה מודגרות תסיסה undergentle עבור 60 דקות ב 4 ° C.
- Vybrant CM-diI מוכתם phosphatidylserine / ceramide שלפוחית הם התאוששו על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C.
- גלולה (ורוד) הוא resuspended במאגר 100 טריס μl שיושלם עם γS-GTP (100 מיקרומטר), התוצר המקומי הגולמי (1 מ"מ), GST-Par6 (100 ננוגרם) או GST-Cdc42 (500 ng) ו מודגרות נוספת 3 ח ב 4 ° C (כל שילוב אחר של חלבונים רקומביננטי של עניין ניתן להשתמש כאן).
- Annexin V-חיץ (5 μl של פתרון 20x מלאי) ו Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים (50 μl) מוסיפים את תערובת התגובה מודגרות תחת תסיסה עדינה למשך 30 דקות אחר ב 4 ° C.
- Annexin V-MACS מתבצע בעקבות פרוטוקול של הספק כפי שתואר לעיל. חלק elution (1 מ"ל) הוא בתוספת של 10 מיקרוגרם ovalbumin טהור כסיוע משקעים. חלבון מרוכזת על ידי משקעים ווסל-Flugge ונותחו על ידי SDS-PAGE/immunoblotting כפי שתואר לעיל 8.
- כמות השומנים שלפוחית eluted הוא לכימות על ידי זיהוי של Vybrant CM-diI (ורוד) בשלב אורגני (כלורופורם / מתנול) התגובה משקעים ווסל Flugge. כמות חלבון ניתח הוא מנורמל על כמויות שוות של שלפוחית השומנים.
3. תוצאות
LIMACS טיהור PKCζ-EGFP ואת תחום מחייב ceramide C20ζ-EGFP
Lysate דטרגנט חופשי של תאים MDCK להביע באורך מלא PKCζ C-סופני קשור חלבון פלואורסצנטי ירוק (FLζ-EGFP) או תחום מחייב ceramide הסופית ב-C של PKCζ (C20ζ-EGFP) הודגר עם phosphatidylserine / שלפוחית ceramide כמו המתואר הפרוצדורות. לאחר elution הטור MACS, חלבון נותח באמצעות immunoblotting ונוגדנים נגד PKCζ ו EGFP לגילוי החלבון eluted 2.
באיור 1. LIMACS של EGFP שכותרתו PKCζ ו שבר בטרמינל C-C20ζ שלה באמצעות phosphatidylserine / ceramide שלפוחית.
דטרגנט ללא lysates של תאים MDCK להביע EGFP (כמו שליטה בלתי מחייב), באורך מלא PKCζ-EGFP, או מחייב ceramide, בטרמינל C-שבר C20ζ-EGFP הודגרו עם phosphatidylserine / שלפוחית ceramide כמתואר בסעיף הפרוצדורות . לאחר השימוש LIMACS, חלבון היה eluted עם חיץ מדגם SDS ונותחו על ידי SDS-PAGE ו immunoblotting. הפאנל השמאלי מראה כי EGFP לא לאגד את שלפוחית שמר עם ה-V-linked חרוזים Annexin מגנטי. הפאנל האמצעי הנכון מראה באורך מלא PKCζ-EGFP ו-C20ζ EGFP נשמרו בשל מחייב ceramide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לבחון את האינטראקציה בין השומנים ספציפי לבין חלבון מחייב שלה הקשו על ידי הטבעה של שומנים בקרום התא. קרום התא מורכב מתערובת של שומנים וחלבונים כמה זה מאורגן microdomains שומנים או רפסודות. לכן, שיתוף טיהור microdomains וחלבונים לא יכול להבחין בבירור אם החלבון נקשר ישירות שומנים או מועשר רק במבנה microdomain. שיטות אחרות באמצעות ליפידים מוגדרים מצופה על משטחים כגון ELISAs שומנים או Plasmon ספקטרוסקופיית תהודה יכול לזהות את האינטראקציה של השומנים ספציפית עם חלבון מחייב שלה .. עם זאת, כדי לקבוע את האינטראקציה בסביבה קרום רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, את פני השטח (למשל, עבור Plasmon ספקטרוסקופיית תהודה) חייב להיות מצופה שלפוחית שומנים או ליפוזומים.
פיתחנו השומנים רומן שלפוחית assay מחייב כחלופה אלה השיטות הקודמות. החידוש נובע שילוב השומנים עוגן (phosphatidylserine) לתוך שלפוחית, אשר מאפשר בידוד של שלפוחית השומנים עם Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים. לכן, אנו קוראים לו השומנים assay שלפוחית בתיווך זיקה כרומטוגרפיה באמצעות תא מגנטי מיון מופעל (LIMACS). LIMACS יכול להתבצע עבור חלבונים אנדוגניים, החלבונים המתבטאת בתאים, או חלבונים רקומביננטי מחדש במתחם חלבון שומנים 1-3.
החלבון חייב שלפוחית השומנים אז יכול להיות התאושש על ידי פשוט לוקח את הטור MACS מדוכן מגנטי משחררי אותו עם המאגר המתאים. זה יכול להיות חיץ תואם אנזים למדידת פעילות האנזים ב eluate או חיץ SDS מדגם לבצע ניתוח באמצעות חלבון SDS-PAGE ו immunoblotting. אם אתה משתמש חיץ SDS מדגם העמודה MACS לא צריך להסיר מדוכן מגנטי, אשר מאפשר שמירה של חרוזים מגנטיים על דוכן העדים.
ישנם אמצעי הזהירות שיש לנקוט בעת שימוש LIMACS. ככל הנראה, LIMACS לא ניתן להשתמש lysate עם חומר ניקוי, כי זה יהרוס את שלפוחית השומנים. כמו כן, יש להיבדק אם חלבון מחייב של השומנים היעד גם נקשר phosphatidylserine כי זה השומנים משמש כעוגן המחייב של שלפוחית כדי Annexin V-מצומדות חרוזים מגנטיים. . במקרים מסוימים, עלולה לפגוע phosphatidylserine מחייב חלבון המטרה. לכן, שולטת שלילית שולטת עם כמויות שונות של phosphatidylserine צריכים להיכלל לתוך assay. Thesecontrols יכול להתבצע בקלות באמצעות שלפוחית המכילה שומנים רק phosphatidylserine או תערובת של phosphatidylserine עם שומנים בלתי מחייב. שולטת שלילי כולל נדרש גם עבור lysates תא המכילים כמות משמעותית של phosphatidylserine אנדוגני. כדי למנוע זיהום עם ממברנות שומנים בדם או שלפוחית אנדוגני מומלץ לנקות את התא lysate ידי הכללת שלב ב ultracentrifugation XG 100,000 עבור 1 ח ברור כי חלבונים מחייב השומנים supernatant יכול להיות רק cytosolic, המהווה הגבלה של ההליך LIMACS. ישנה אפשרות להאריך LIMACS כדי לעגן שומנים אחרים כגון GM1 ו-B כולרה טוקסין למקטע מצומדות עם חרוזים מגנטיים.
כרגע אנחנו בוחנים את השימוש של שומנים בדם נוגדנים ספציפיים עבור LIMACS, אשר יהפוך את השימוש של שומנים עוגן להכנת שלפוחית מיותרים. אחד ההיבטים שביושר LIMACS הוא הבידוד של המתחם השומנים חלבון המאפשר מגוון רחב של שיטות אנליטיות חלבון כי הם לא ישימה .. לדוגמה, השתמשנו LIMACS לבודד הקוטביות מחדש חלבון מורכב של Par6/Cdc42 הקשורים aPKC ceramide הנכנס. לכן, LIMACS היא שיטה חדשנית עוצמה לניתוח ובידוד של שומנים בדם קשורה קומפלקסים חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH R01NS046835 ו R01AG034389, ואת מצעד הפרוטות מענק 6FY08-322. תודה מיוחדת מוקדשת גב 'אלינור בראון (Miltenyi BIOTEC, אובורן, CA) שעזר מאוד עם תובנה אותה טכנולוגיה MACS. Miltenyi סיפקה בנדיבות את החומר המשמש הפגנה של הניסויים ללא עלות. אני אסירת תודה גם לד"ר Guanghu וואנג (Medical College של גאורגיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה, אוגוסטה, GA) מי שהפיק את PKCζ להביע שורות תאים. תמיכה על ידי המכון לרפואה מולקולרית בבית הספר לרפואה של גרוזיה / גאורגיה למדעי הבריאות באוניברסיטה (בניהולו של ד"ר לין מי) הוא גם הודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
