Липидов везикул-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных Активированный сортировки клеток (LIMACS): новый метод для анализа Белково-липидные взаимодействия
Summary
Для проверки взаимодействия белка с его целевым липидного мы использовали MACS и Аннексин V-сопряженных магнитных гранул и липидных везикул синтезируется из липидных цели и Аннексин V-связывающих фосфатидилсерина. Белки связаны с целевой липидного совместно очищенный и проанализированы после элюирования из бисера.
Abstract
Анализ липидного взаимодействия белка трудно, потому что липиды встраиваются в клеточные мембраны и, следовательно, недоступными для большинства процедур очистки. В качестве альтернативы, липиды могут быть покрыты на плоских поверхностях, который используется для липидного ИФА и Plasmon резонансной спектроскопии. Тем не менее, липидов поверхности покрытия не образуют микродоменной структуры, которые могут иметь важное значение для липидного связующие свойства. Кроме того, эти методы не позволяют для очистки больших количеств белков привязки к их липидов цели.
Чтобы преодолеть эти ограничения тестирования взаимодействия липидных белка и очистить липидного связывающих белков, мы разработали новый метод называют липидные пузырьки-опосредованной аффинной хроматографии с использованием магнитных активированных сортировки клеток (LIMACS). В этом методе, липидные пузырьки готовы с целевой липидного и фосфатидилсерина, как якорь для липидного Аннексин V MACS. Фосфатидилсерин является вездесущий фосфолипид клеточных мембран, который показывает высокое сродство к Аннексин белка В. Использование магнитных шариков конъюгированных с Аннексин V фосфатидилсерина содержащих пузырьки липидного будет связываться с магнитных бус. Когда липидные пузырьки инкубируют с Клеточный лизат связывание белка с целевой липидного также будет связан с бисером и могут быть совместно очищают, используя MACS. Этот метод может также использоваться для проверки, если рекомбинантных белков восстановить белковый комплекс привязки к целевой липидов.
Мы использовали этот метод, чтобы показать взаимодействие атипичной PKC (aPKC) с сфинголипида церамида и сотрудничать очистить простаты апоптоз ответ 4 (PAR-4), связывание белка с церамида связанных aPKC. Мы также использовали этот метод для воссоздания церамида связанных комплекс рекомбинантного aPKC с клеточной полярности связанных белков Par6 и Cdc42. С липидные пузырьки могут быть подготовлены с различными sphingo или фосфолипиды, LIMACS предлагает универсальный тест на липид-белковых взаимодействий в липидных среды, которая напоминает, что тесно клеточной мембраны. Дополнительная белковых комплексов липид можно получить, используя протеомики анализ липидного связывающий белок совместно с очищенной липидных везикул.
Protocol
Discussion
Для проверки конкретного взаимодействия между липидной и его связывания с белками препятствуют вложению липидов в клеточной мембране. Клеточная мембрана состоит из смеси нескольких липидов и белков, и организованная в липидных микродоменов или плотах. Таким образом, совместное очис?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R01NS046835 и R01AG034389 и марте Dimes грант 6FY08-322. Отдельное спасибо посвящена г-жа Элеонора Браун (Miltenyi Biotec, Оберн, штат Калифорния), который очень помогло с ней понимание технологии MACS. Miltenyi щедро предоставили материал, используемый для демонстрации экспериментов на безвозмездной основе. Я также благодарен доктору Guanghu Ванг (Медицинский колледж Джорджии / Грузия медицинских наук университета, Augusta, GA), создавшим PKCζ выражения клеточных линий. Поддержка со стороны Института молекулярной медицины Медицинского колледжа Джорджии / Грузия медицинских наук университета (под руководство доктора Лин Мей) также признается.
Materials
Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns were provided by Miltenyi Biotec, Inc. (Auburn, CA). All lipids were of highest purity and obtained from Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL).
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
