Summary
MACS ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk ve hedef lipid ve Annexin V-bağlayıcı fosfatidilserin sentezlenen lipid veziküller hedef lipid protein etkileşim test etmek için. Ortak hedef lipid bağlı Proteinler saflaştırılmış ve boncuk elüsyon sonra analiz edilir.
Abstract
Lipidler çoğu arıtma prosedürleri erişilemez duruma, bu nedenle hücre zarlarında gömülü ve çünkü lipid protein etkileşim analizi zordur. Alternatif olarak, lipidler, lipid ELISA ve Plazmon rezonans spektroskopi için kullanılan gibi düz yüzeyler üzerinde kaplı olabilir. Ancak, yüzey kaplama lipidler, lipid bağlayıcı özellikleri için önemli olabilir microdomain yapılar oluşturmak yok. Ayrıca, bu yöntemleri, hedef lipidler bağlayıcı proteinlerin büyük miktarlarda arıtma için izin vermez.
Lipid protein etkileşim test bu sınırlamaları aşmak ve lipid bağlayıcı proteinlerin arındırmak için manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) kullanarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi olarak adlandırılan yeni bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, lipid veziküller Annexin V MACS çapa lipid olarak hedef lipid ve fosfatidilserin ile hazırlanmıştır. Fosfatidilserin protein Annexin V. fosfatidilserin içeren lipid veziküller manyetik boncuk bağlamak Annexin V konjuge manyetik boncuklar kullanarak yüksek afinite gösteren her yerde bulunan bir hücre zarı fosfolipid. Hedef lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller lizat bir hücre ile inkübe edilir boncuklar bağlı olacak ve MACS kullanarak ortak arındırılmalıdır. Bu yöntem ayrıca test etmek için kullanılır rekombinant proteinler sulandırmak hedef lipid bağlayıcı bir protein kompleksidir.
Biz sphingolipid seramid ve co-purify prostat apoptozis cevabı 4 (PAR-4), seramid ilişkili aPKC için bağlayıcı bir protein atipik PKC (aPKC) etkileşimi göstermek için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca hücre polarite ilgili proteinler Par6 ve Cdc42 rekombinant aPKC seramid ile ilişkili kompleks sulandırıldıktan için bu yöntemi kullanmıştır. Lipid veziküller sphingo-veya fosfolipitler çeşitli hazırlanmış olabilir, hücre zarından yakından benzer bir lipid ortamda LIMACS lipid-protein etkileşim için çok yönlü bir test sunuyor. Ek lipid protein kompleksleri lipid bağlayıcı protein, lipid veziküller ile birlikte arıtılmış proteomik analizi kullanılarak tespit edilebilir.
Protocol
1. Giriş
Manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) tekniği kullanılarak lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi 1-3 seramid ile ilişkili protein kompleksleri izole etmek için laboratuvarda geliştirilmiştir. Başlangıçta, lipid veziküller manyetik partikül konjuge Annexin V (fosfatidilserin için son derece ilgin) kullanarak MACS veziküller ve ilişkili proteinler izole etmek için izin seramid ve fosfatidilserin yapılmıştır. Seramid ile ilişkili bir polarite karmaşık ve seramid-bağlayıcı proteinlerin hücre izolasyonu in vitro sulandırıldıktan 3 lizatları LIMACS tekniği kullanılmıştır. LIMACS veziküller (örneğin, glikolipid specifc lektinler veya lipid antikorlar) izolasyonu için diğer etkileşim ortaklarını kullanarak değiştirilebilir.
2. Deneysel Prosedürler
Lipid Veziküller hazırlanması ve aPKCBinding Tahliller
- Lipid veziküller fosfatidilserin (105 mikrogram) ve büyük lipozom hazırlama 1,4-7 için modifiye işlemleri takiben C16-seramid (85 mikrogram) ekimolar miktarda kurutulmuş karışımlar elde edilir.
- Lipid karışımları sonra yeniden süspanse ve 1 saat 50 mM Tris / HCl (pH 7.5) ve 150 mM NaCl içeren vezikül tampon 100 ul sonicated.
- 0.1 mM MnCl 2 ile desteklenmiş vezikül tampon 300 ul ekledikten sonra, örnekleri, 4 20 dakika 12.000 μ g ° C santrifüj
- Pelet (büyük lipid veziküller) 100 ul vezikül tampon yeniden bekletildi ve 37 az 1 saat süreyle Vybrant CM-DII 1 nmol ile inkübe ° C MACS ayrılıktan sonra vezikül fraksiyonu görselleştirmek. Vybrant CM-DII özellikle lipid membranlar içeren kırmızı bir floresan boya.
- Deterjan ücretsiz cep lizat santrifüj membranöz enkaz kaldırma hipotonik tampon (proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 10 mM Tris / HCl (pH 7.0)) 300 ul sonication / hücre homojenizasyon hazırlanmıştır. 1 saat için 100.000 xg'de santrifüj adım fosfatidilserin içeren endojen membran ile hücre lizat kirlenmesini önlemek için ilave edilmelidir.
- Temizlenir lizat lipid vezikül süspansiyon eklenir ve karışım 4 ° C'de 2 saat inkübe
- Reaksiyon karışımı, 20x Annexin V bağlayıcı Annexin V konjuge manyetik boncuklar içeren bir çözüm tampon ve 50 ul 20 ul ile desteklenmiş 1 saat 4 ° C inkübasyon takip
- MACS üreticinin (Miltenyi Biotec, Inc.) Protokolü göre yapılır. Mikroplaka floresan okuyucu kullanarak akış yoluyla ve elüsyon kesirler Vybrant CM-DII floresan izlenmesi lipid veziküllerin varlığı ve miktarı tarafından belirlenir.
- Veziküler lipit miktarı ve floresan yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki vezikül bağlı Vybrant CM DII Annexin V-MACS uygulanan lipid karışımı kantitatif yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) tarafından doğrulanmadı.
- Seramid / fosfatidilserin veziküller aPKC veya diğer proteinleri bağlama reaksiyon özgüllüğü 1 saat 4 ° C inkübasyon öncesinde hücre lizat inkübe 1 mikrogram anti-PKCζ tavşan poliklonal antikor kullanarak bir antikor yarışma yöntemi ile doğrulanır lipid veziküllerin.
- MACS eluat seramid / fosfatidilserin veziküller bağlayıcı protein, SDS-PAGE ve immunoblotting tarafından analiz edilir.
In vitro lipid-protein polarite kompleksi
- In vitro lipid-protein polarite kompleksi sulandırıldıktan, önceki bölümde açıklandığı gibi LIMACS prosedürü izleyerek yapılır . Kısa, fosfatidilserin (420 mikrogram) ve C16-seramid (107 mikrogram), organik çözücü kurutulur.
- Kurutulmuş lipidler ul vezikül tampon 500 (150 mM NaCl, 50 mM Tris / HCl, pH 7.5) sonication altında yeniden süspanse.
- 10 mM MnCl2, 1 ul Vybrant CM-DII ve PKCζ, 500 ng (insan rekombinant) Beş ul eklenir ve reaksiyon karışımı 4 undergentle ajitasyon 60 dakika inkübe edilir ° C
- Vybrant CM-DII lekeli fosfatidilserin / seramid veziküller 60 dk 4 ° C 12.000 xg'de santrifüj tarafından kurtarıldı
- Pelet (pembe) 100 ul Tris tamponu yeniden süspanse ve γS-GTP (100 mcM), GSYH (1 mM), GST-Par6 (100 ng), ya da GST-Cdc42 (500 ng) ile desteklenmiş ve daha 3 inkübe 4 h ° C (ilgi rekombinant proteinlerin başka herhangi bir kombinasyonu kullanılabilir).
- Annexin V-tampon (20x stok solüsyonu 5 ul) ve Annexin V-konjuge manyetik boncuk (50 ul) eklenir ve reaksiyon karışımı yavaşça sallanarak başka bir 30 dakika 4 ° C'nin altında inkübe
- Annexin V-MACS tedarikçinin protokolü daha önce açıklandığı gibi yapılır. Elüsyon fraksiyonu (1 ml), 10 mikrogram ile yağış yardımcı olarak saf ovalbumin tamamlanmaktadır. Protein Wessel-Flugge yağış konsantre ve daha önce 8 açıklandığı gibi SDS-PAGE/immunoblotting tarafından analiz edilir.
- Wessel Flugge yağış reaksiyon organik (kloroform / metanol) aşamasında Vybrant CM-DII (pembe) tespiti ile yıkandı, lipid veziküllerin miktar miktarı. Analiz protein miktarı eşit miktarda lipid veziküllerin normalize.
3. Sonuçlar
LIMACS PKCζ-EGFP arıtma ve seramid bağlayıcı etki alanı C20ζ-EGFP
Tam uzunlukta ifade MDCK hücreleri bir deterjan içermeyen lizat PKCζ C-terminal, yeşil floresan protein (FLζ EGFP) veya PKCζ (C20ζ-EGFP) C-terminalindeki bir seramid bağlayıcı etki alanı bağlantılı fosfatidilserin / seramid veziküller ile inkübe Deneysel Prosedürler nitelendirdi. MACS sütun elüsyon sonra, protein tespiti için yıkandı, protein 2 PKCζ ve EGFP immunoblotting ve karşı antikorlar kullanılarak analiz edildi.
Şekil 1 LIMACS EGFP-etiketli PKCζ ve C-terminal parçası C20ζ fosfatidilserin / seramid veziküller.
Deneysel Usul bölümünde açıklandığı gibi, EGFP (bağlayıcı olmayan bir kontrolü gibi), tam uzunlukta PKCζ-EGFP veya seramid bağlama, C-terminal parçası C20ζ-EGFP ifade MDCK hücreleri Deterjan lizatları fosfatidilserin / seramid veziküller ile inkübe edildi. . LIMACS kullanarak sonra, protein, SDS örnek tamponu ile yıkandı, ve SDS-PAGE ile analiz ve immunoblotting. Sol panelinde EGFP Annexin V bağlantılı manyetik boncuk muhafaza veziküller bağlamak olmadığını gösterir. Orta ve sağ panelde o tam uzunlukta PKCζ-EGFP C20ζ-EGFP seramid için bağlayıcı nedeniyle tutuldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre zarında lipid gömerek bir lipid ve bağlayıcı protein arasında belirli bir etkileşim test etmek için bir engel teşkil etmektedir. Hücre zarı, birkaç lipitleri ve proteinleri karışımından oluşur ve lipid microdomains veya sallar düzenlenmiştir. Bu nedenle, bir protein, lipid doğrudan bağlar ya da sadece bir microdomain yapısı zenginleştirilmiş microdomains ve proteinlerin ortak arıtma açıkça ayırt edemez. Lipid ELISA'larla veya Plasmon rezonans spektroskopi gibi yüzeyleri kaplanmış tanımlanan lipidler kullanan diğer yöntemler belirli bir lipid bağlayıcı protein ile etkileşimi algılayabilir .. Ancak, fizyolojik ilgili bir membran ortamda yüzey (örneğin, Plazmon rezonans spektroskopi), lipid veziküller veya lipozomlar ile kaplı olması gerekir, bu etkileşimin belirlemek için.
Biz bu önceki yöntemlere alternatif olarak bir roman lipid vezikül bağlayıcı tahlil geliştirdi. Annexin V-konjuge manyetik boncuk lipid veziküller izolasyonu sağlar veziküller içine bir çapa lipid (fosfatidilserin) içeren yenilik geliyor. Bu nedenle, manyetik aktive hücre sıralama (LIMACS) kullanarak bu testte lipid vezikül aracılı afinite kromatografisi olarak nitelendirdi. LIMACS endojen proteinlerin yapılabilir hücreleri, ya da rekombinant proteinleri ifade proteinler lipid protein kompleksi 1-3 sulandırılmış .
Lipid veziküller bağlı protein daha sonra sadece manyetik stand MACS sütun alınması ve uygun bir tampon ile salınımlı tarafından telafi edilebilir. Bu eluat veya SDS örnek tampon kullanarak ve immunoblotting SDS-PAGE protein analizi gerçekleştirmek için enzim aktivitesini ölçmek için bir enzim uyumlu tampon olabilir. MACS sütun SDS örnek tampon kullanıyorsanız, stand manyetik boncuk saklama için izin manyetik stand, kaldırılacak bulunmamış.
LIMACS kullanırken alınması gereken önlemler vardır. Besbelli ki, bu lipid veziküller yok çünkü LIMACS bir deterjan lizat ile kullanılabilir değildir. Ayrıca, bu lipid veziküller Annexin V-konjuge manyetik boncuk bağlanması için bir çapa olarak kullanılması nedeniyle hedef lipid bağlayıcı protein de fosfatidilserin bağlanarak test edilmesi gerekir. . Bazı durumlarda, fosfatidilserin hedef protein bağlayıcı bozabilir. Bu nedenle, fosfatidilserin çeşitli miktarlarda negatif kontroller ve denetimler tahlil dahil olması. Thesecontrols sadece fosfatidilserin, bağlayıcı olmayan lipidler fosfatidilserin bir karışımını içeren lipid veziküller kullanarak kolayca yapılabilir. Negatif kontroller de dahil olmak üzere, aynı zamanda, önemli bir miktarda endojen fosfatidilserin içeren hücre lizatları için gereklidir. 1 saat boyunca 100.000 xg'de bir Ultrasantrifügasyon adım da dahil olmak üzere hücre lizat temizlemek için tavsiye edilir endojen lipid membranlar veya vezikül ile kontaminasyonu engellemek için Süpernatantı lipid bağlayıcı proteinlerin sadece sitozolik LIMACS prosedürün bir sınırlama olabilir açıktır. GM1 ve manyetik boncuk ile konjuge kolera toksin B altbirim gibi diğer çapa lipidler LIMACS uzatmak için olasılığı vardır.
Şu anda veziküllerin hazırlanması için çapa lipid kullanımını gereksiz kılacak LIMACS lipid-spesifik antikorların kullanımı, keşfediyoruz. LIMACS yararlı yönlerini biri uygulanabilir değildir protein analitik yöntemlerin çeşitli sağlayan lipid protein kompleksinin izolasyonu .. Örneğin, seramid bağlı aPKC ile ilişkili Par6/Cdc42 sulandırılmış polarite protein kompleksi izole LIMACS kullanılır. Bu nedenle, LIMACS güçlü bir analiz ve lipid ile ilişkili protein kompleksleri izolasyonu için yeni bir yöntem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe programı R01NS046835 ve R01AG034389 ve Dimes hibe 6FY08-322 Mart tarafından desteklenmiştir. MACS teknolojisi, onun bakış açısı ile muazzam yardımcı Eleanor Brown (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) için ayrılmış özel bir teşekkür ediyorum. Miltenyi cömertçe deneyler gösteri için hiçbir ücret ödemeden kullanılan malzeme sağladı. Ben de hücre hatları ifade PKCζ oluşturulan Dr. Guanghu Wang (Medical College of Georgia / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Augusta, GA) minnettarım. Destek Gürcistan / Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi (Dr Lin Mei müdürlüğüne altında) Tıp College Moleküler Tıp Enstitüsü tarafından da kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-conjugated magnetic beads and MACS micro and minicolumns | Miltenyi Biotec | ||
| Lipids (of highest purity) | Avanti Polar Lipid, Inc |
References
- Wang, G. Direct binding to ceramide activates protein kinase Czeta before the formation of a pro-apoptotic complex with PAR-4 in differentiating stem cells. J Biol Chem. 280, 26415-26424 (2005).
- Wang, G., Krishnamurthy, K., Umapathy, N. S., Verin, A. D., Bieberich, E. The carboxyl-terminal domain of atypical protein kinase Czeta binds to ceramide and regulates junction formation in epithelial cells. J Biol Chem. 284, 14469-14475 (2008).
- Chalfant, C. E. De novo ceramide regulates the alternative splicing of caspase 9 and Bcl-x in A549 lung adenocarcinoma cells. Dependence on protein phosphatase-1. J Biol Chem. 277, 12587-12595 (2002).
- Simon, C. G., Holloway, P. W., Gear, A. R. Exchange of C(16)-ceramide between phospholipid vesicles. Biochemistry. 38, 14676-14682 (1999).
- Goni, F. M., Contreras, F. X., Montes, L. R., Sot, J., Alonso, A. Biophysics (and sociology) of ceramides. Biochem Soc Symp. , 177-188 (2005).
- Kumagai, K. CERT mediates intermembrane transfer of various molecular species of ceramides. J Biol Chem. 280, 6488-6495 (2005).
- Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138, 141-143 (1984).
