Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen
Summary
Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av<em> Drosophila melanogaster</em> Är ett viktigt modellsystem för att studera normal synaptisk funktion samt störningar för att synapserna finns i vissa neurologiska sjukdomar. Vi presenterar ett protokoll för dissekering av<em> Drosophila</em> Larver motoriska system och immunfärgning för aktiv zon proteiner inom NMJ.
Abstract
Den Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en utmärkt modell för studier av synaptiska struktur och funktion. Drosophila är välkänd för hur lätt av kraftfulla genetiska manipulationer och larver nervsystemet har visat sig särskilt användbara för att studera inte bara normal funktion, men också störningar som följer med en del neurologiska sjukdomar (Lloyd och Taylor, 2010). Många viktiga synaptiska molekyler som finns i Drosophila finns också hos däggdjur och som de flesta CNS retande synapser i däggdjur, är Drosophila NMJ glutamaterg och visar aktivitet beroende ombyggnad (Koh et al., 2000). Dessutom kan Drosophila nervceller kan identifieras eftersom deras innervation mönster är stereotypa och repetitiva vilket gör det möjligt att studera identifierats synaptiska terminaler, till exempel mellan motoriska nervceller och kroppen vägg muskelfibrer att de innerverar (Keshishian och Kim, 2004). Förekomsten av evolutionärt bevarat synaps komponenter tillsammans med enkel genetisk och fysisk manipulation gör Drosophila modell idealisk för att undersöka mekanismerna bakom synaptiska funktion (Budnik, 1996).
Den aktiva zoner på synaptiska terminaler är av särskilt intresse eftersom dessa är områden av signalsubstansen release. NC82 är en monoklonal antikropp som erkänner Drosophila proteinet Bruchpilot (BRP), en CAST1/ERC familjemedlem som är en viktig del av den aktiva zonen (Wagh et al., 2006). BRP visades direkt forma den aktiva zonen T-bar och är ansvarig för att effektivt klustring Ca 2 +-kanaler under T-stången densitet (Fouquet et al., 2009). Mutanter av BRP har minskat Ca 2 +-kanal densitet, deprimerad framkallade vesikler release, och förändrade kortsiktiga plasticitet (Kittel et al., 2006). Ändringar aktiva zoner har observerats hos Drosophila sjukdom modeller. Till exempel visade immunofluorescens med NC82 antikropp som den aktiva zonen tätheten sänktes i modeller av amyotrofisk lateralskleros och Pitt-Hopkins syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Således kan bedömningen av aktiva zoner eller andra synaptiska proteiner i Drosophila larver modeller av sjukdomen ett värdefullt första ledtråd till förekomsten av en synaptisk defekt.
Förbereda hela montering dissekeras Drosophila larver för immunofluorescens analys av NMJ kräver en del skicklighet, men kan uppnås genom att de flesta forskare med lite övning. Presenteras är en metod som möjliggör flera larver som skall dissekeras och immunostained i samma dissektion maträtt, vilket begränsar miljömässiga skillnader mellan varje genotyp och ger tillräcklig djur för förtroendet reproducerbarhet och statistisk analys.
Protocol
Discussion
För nervceller, är det synaptiska terminalområdet av avgörande betydelse, och är bron för korrekt kommunikation mellan post-och pre-synaptisk celler. Ett kraftfullt sätt att undersöka hälsan hos neuron i sjukdomen modellerna är att analysera proteiner från synaptiska terminalen med immunofluorescens. Den immunofluorescens metod som presenteras här ger forskaren att undersöka många larver samtidigt samtidigt begränsa de miljömässiga skillnader mellan grupper. Det centrala nervsystemet hos Drosophila<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Nael Alami och Dr Nam Chul Kim för deras hjälpsamma kommentarer om detta manuskript.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
