Summary
यहाँ हम एक की लेबलिंग की अनुमति प्रक्रिया का वर्णन
Abstract
जबकि Edwardsiella ictaluri चैनल कैटफ़िश Ictalurus punctatus के एक प्रमुख रोगज़नक़ है और 1,2 पहले लगभग तीन दशकों की खोज की गई है, अब तक, इन लेखकों के ज्ञान के सर्वोत्तम करने के लिए कोई विधि में सीटू दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है histological वर्गों में बैक्टीरिया.
जबकि जीवाणु स्थानीयकरण पिछले प्लेट मायने रखता 3, radiometric लेबल 4, या bioluminescent बैक्टीरिया 5 का उपयोग अध्ययन में vivo में निर्धारित किया गया है, इन अध्ययनों की सबसे केवल सकल अंग स्तर पर प्रदर्शन किया गया एक अपवाद के साथ 6, . इस सीमा को विशेष चिंता का विषय है क्योंकि ई. ictaluri एक जटिल संक्रमण 1,7 चक्र है, और यह डाह कारकों 8,9 के एक किस्म है. ई. के जटिल बातचीत अपने मेजबान के साथ ictaluri साल्मोनेला typhi 10 है, जो उसी वर्गीकरण परिवार में कई मायनों में समान है .
यहाँ हम एक अप्रत्यक्ष इम्युनो - histochemistry मोनोक्लोनल Ed9 Ainsworth एट अल द्वारा वर्णित एंटीबॉडी का उपयोग 11. उपयोग जीवाणुओं का पता लगाने के लिए अनुमति देता है तकनीक का वर्णन.
संक्षेप में, एक अवरुद्ध सीरम आयल एम्बेडेड histological वर्गों के लिए लागू किया जाता है गैर - विशिष्ट नीलामी को रोकने के है. ई.: तो फिर, अनुभागों प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated हैं ictaluri विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी Ed9. अतिरिक्त एंटीबॉडी दूर rinsed और FitC लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ रहे हैं. Rinsing के बाद, एक फ्लोरोसेंट विशिष्ट बढ़ते मध्यम वर्गों के साथ बढ़ रहे हैं.
यह ई. का पता लगाने के लिए अनुमति दी चैनल कैटफ़िश के ऊतकों के histological वर्गों में स्वस्थानी में ictaluri.
Protocol
1. बैक्टीरियल चुनौती
- 30 में रातोंरात बैक्टीरिया ग्रो ° सी ब्रेन हार्ट आसव शोरबा मिलाते में.
- मछली के टैंक में पानी संचलन बंद करो और 1 के 100 में एकाग्रता (प्रति लीटर 10 मिलीलीटर, उदाहरण के लिए) में शोरबा जोड़ने.
- एक घंटे के ऊष्मायन के बाद, टैंक में पानी परिसंचरण को पुनः आरंभ करने के लिए बाहर शेष बैक्टीरिया फ्लश.
2. नमूनाकरण
- नमूनाकरण बार और अंगों के अध्ययन के उद्देश्य के निर्भर करता है लेकिन हमारे अध्ययन में, हम निम्नलिखित नमूना अंक का प्रयोग किया है: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 और 175 घंटे के बाद संक्रमण .
- गहरे नाले, पार्श्व रेखा, आँत, तिल्ली के साथ पीछे की मांसपेशियों,: हर बार अंक कम MS222 और नमूना निम्नलिखित अंगों (चयन नमूना अंगों के संक्रमण की प्रक्रिया के क्या जाना जाता है के आधार पर किया गया था) से युक्त पानी में विसर्जन द्वारा छह मछली euthanize जिगर, पेट, हृदय, सिर गुर्दे, और ट्रंक गुर्दे.
- नमूने पर, तुरंत histological कैसेट में अंगों लोड और उन्हें 1% formalin में दो घंटे के लिए विसर्जित.
- दो घंटे के निर्धारण के बाद, 50% इथेनॉल से formalin के लिए कैसेट हस्तांतरण, जहां वे एम्बेडिंग जब तक रहते हैं.
- आयल रातोंरात एक ऊतक टेक वीआईपी 3000 ऊतक (Sakura टेक, Torrance, कैलिफोर्निया) प्रोसेसर और एक Leica RM2255 microtone (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Bannockburn, इलिनोइस) का उपयोग 5μm पर अनुभाग का उपयोग कर अंगों एम्बेड.
3. Dewaxing वर्गों
- एक धुंधला लगभग 5 मिनट के लिए स्पष्ट अनुष्ठान के साथ भर के सभी मोम भंग के लिए अनुमति देने के गर्त में वर्गों को विसर्जित कर दिया. रैक लिफ्ट और बंद नाली अतिरिक्त मोम विलायक.
- 5 मिनट के लिए एक स्पष्ट अनुष्ठान के दूसरे कंटेनर में वर्गों को विसर्जित कर दिया. कुछ का उपयोग करता है के बाद, पहली और पहले और दूसरे कंटेनर के बीच कंटेनर वैकल्पिक में विलायक जगह.
- 100% शराब में वर्गों को विसर्जित करने के लिए विलायक मोम हटायें.
- 100% शराब की एक दूसरे गर्त में वर्गों विसर्जित कर दिया.
- वर्गों को 70% शराब के गर्त में विसर्जित कर दिया.
- नल का पानी चलाने के लिए शराब के सभी निशान हटाने में वर्गों को विसर्जित कर दिया.
4. बफर तैयारी
- तैयार फॉस्फेट आसुत जल और पीएच के 1 लीटर में 8.0 छ NaCl, 0.2 ग्राम KCl, 1.15 छ ना 2 HPO 4 और 0.2 छ 2 के.एच. पीओ 4 7.4 भंग करके खारा buffered.
- पीबीएस पतला 0.9X के लिए आसुत पानी की 100 मिलीलीटर के लिए पीबीएस की 900 मिलीलीटर जोड़कर.
- 2 मिलीलीटर माउस सीरम जोड़कर सीरम अवरुद्ध तैयार, 200 μl ट्राइटन 100 एक्स और 500 μl BSA 0.9X पीबीएस के 50 मिलीलीटर के लिए.
- तैयार 50 मिमी बिकारबोनिट buffered खारा 500 मिलीलीटर आसुत एच 2 हे में 2.1 छ NaHCO 3 और 4 जी NaCl भंग और 8.2 पीएच titrated द्वारा तैयार की है.
5. Immunhistochemistry
- 0.9X पीबीएस में विसर्जन के द्वारा वर्गों rehydrate.
- सीरम अवरुद्ध करने में 30 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं.
- Ed9 (1 पतला 100 में अवरुद्ध सीरम में) में कमरे के तापमान पर एक अपारदर्शी नम कक्ष में दो घंटे के लिए वर्गों का सेते हैं.
- वर्गों पीबीएस में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 4 बार कुल्ला.
- कमरे के तापमान पर एक अपारदर्शी नम कक्ष में, माध्यमिक एंटीबॉडी के 50 (सीरम अवरुद्ध में 500 गुना पतला बकरी विरोधी माउस FitC लेबल एंटीबॉडी) μl में दो घंटे के लिए वर्गों को सेते हैं.
- वर्गों कुल्ला बिकारबोनिट में 3 बार खारा buffered.
- विआयनीकृत जल में अनुभागों को संक्षिप्त कुल्ला.
6. बढ़ते
- स्लाइड्स के अंधेरे में कुछ मिनट के लिए सूखी छोड़ दें.
- बढ़ते permafluor का उपयोग किया जाता है.
- बढ़ते मध्यम सूखी, preferentially रातोंरात एक अंधेरे शांत वातावरण में, छोड़ो.
7. खुर्दबीन
- Histological वर्गों के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे निरीक्षण के लिए तैयार हैं. फिल्टर, हमारे प्रयोग में, हम एक ओलिंप BX51 एक ट्रिपल (एमसीए टेक्सास रेड FitC) के साथ सुसज्जित खुर्दबीन इस्तेमाल किया. चित्र फ़्रेम (MicroFire, Goleta, कैलिफोर्निया) सॉफ्टवेयर इस्तेमाल किया गया था.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
क्योंकि मछली के ऊतकों के ऑटो प्रतिदीप्ति इतना अधिक है, इन ऊतकों नारंगी त्रिकोणीय फिल्टर के तहत दिखाई देते हैं, आसानी से बैक्टीरिया के लिए एक पृष्ठभूमि प्रदान करेगा.
इस पृष्ठभूमि के खिलाफ, व्यक्तिगत FitC दाग बैक्टीरिया चमकीले हरे डॉट्स के रूप में दिखाई देते हैं, और 200X में अपने रॉड आकार पहचानने (चित्र 1).
बुरा वर्गों झूठी सकारात्मक (rinsing के चरण में एक समस्या के कारण), जो मामले में जीवाणुओं की एक बड़ी संख्या स्लाइड पर समान रूप से उपस्थित होने के लिए दिखाई देगा का गठन कर सकते हैं.
1 चित्रा एक मांसपेशी दो ई. दिखा वर्गों के सूक्ष्मग्राफ. ictaluri (एक तीर और ख) (200x).
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चित्रा 2 प्रयोग के समग्र योजना.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल विवरण कैटफ़िश histological वर्गों में रोगज़नक़ Edwardsiella ictaluri सीटू दृश्य के लिए एक तकनीक है. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली ऐसी प्रोटोकॉल में वर्णित है.
सबसे महत्वपूर्ण कदम है, हमारे अनुभव में, अपर्याप्त धोने के रूप में वर्तमान प्रोटोकॉल के चरण 4.4 में वर्णित के रूप में एंटीबॉडी के rinsing में झूठी सकारात्मक परिणाम हो सकता है.
इस तकनीक के परिणामों की व्याख्या के साथ मुख्य समस्या ऊतक के ऑटो प्रतिदीप्ति है. हालांकि, यह पाया गया कि गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति के विशाल बहुमत के रूप में त्रिकोणीय फिल्टर ज्यादातर समस्या हल है कि का उपयोग कर हरे रंग का फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रम के बाहर होते हैं. इसके अलावा, जबकि इस तकनीक काफी संवेदनशील है, यह कम बैक्टीरियल भार का पता लगाने में विफल कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए उनकी सहायता के विकास और immunohistochemistry प्रदर्शन के लिए मिशेल banes के तकनीकी सहायता के रूप में अच्छी तरह के रूप में डॉ. पेट्री Hanson, डा. ईल और तीमुथियुस ब्राउन पहचान करना चाहते हैं. इस परियोजना के USDA क्रिस परियोजना # MISV - 0801310 और मिसिसिपी पशु चिकित्सा स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
