Summary
Här beskriver vi ett förfarande för märkning av
Abstract
Medan Edwardsiella ictaluri är en viktig patogen för kanal havskatt Ictalurus punctatus och har upptäckts nästan tre decennier sedan 1,2 hittills det bästa av dessa författare kunskaper, har ingen metod tagits fram för att möjliggöra in situ-visualisering av bakterier i histologiska avsnitt.
Även bakteriella lokalisering har bestämts in vivo i tidigare studier med platta räknas 3, radiometriska märkt 4, eller självlysande bakterier 5 har de flesta av dessa studier endast utförts på de grova orgel nivå, med ett undantag 6. Denna begränsning är särskilt oroande eftersom E. ictaluri har en komplex infektion cykel 1,7, och den har en mängd olika virulensfaktorer 8,9. Det komplexa samspelet mellan E. ictaluri med sin värd liknar i många avseenden Salmonella typhi 10, vilket är i samma taxonomiska familj.
Här beskriver vi en teknik som möjliggör detektion av bakterier med hjälp av indirekta immunhistokemisk med den monoklonala antikroppen Ed9 beskrivs av Ainsworth et al. 11.
Kortfattat är en blockerande serum tillämpas paraffininbäddad histologiska sektioner för att förhindra icke-specifik bidar. Sedan är de avsnitt inkuberas med den primära antikroppen: E. ictaluri specifik monoklonal antikropp Ed9. Överskott av antikroppar sköljs bort och FITC-märkta sekundära antikroppar tillsätts. Efter sköljning, är de sektioner monterade med ett fluorescerande specifik monteringsmedel.
Detta gjorde det möjligt för detektion av E. ictaluri på plats i histologiska delar av vävnader kanal havskatt.
Protocol
1. Bakteriell utmaning
- Växa bakterier över natten vid 30 ° C i skaka Brain buljong Heart Infusion.
- Sluta vattencirkulation i akvarier och lägga buljong i koncentration av 1 på 100 (10 ml per liter, till exempel).
- Efter en timmes inkubation, starta vattencirkulationen i tankarna att spola ut kvarvarande bakterier.
2. Provtagning
- Provtagning gånger och organ är beroende av syftet med studien, men i vår studie har vi använt följande provtagningsplatser: 1, 6, 16, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 110, 125 och 175 timmar efter infektion .
- Vid varje tidpunkter, euthanize sex fiskar genom nedsänkning i vatten som innehåller MS222 och prova följande organ (urval av de utvalda organen var baserad på vad som är känt av infektionen processen): gälar, bakre musklerna längs sidolinjen, tarmar, mjälte, lever, mage, hjärta, huvud njure, och bål njure.
- Vid provtagning, omedelbart ladda organ i histologiska kassetter och sänk ner dem i två timmar i 1% formalin.
- Efter två timmar fixering, överföra kassetterna från formalin till 50% etanol där de stannar tills inbäddning.
- Paraffin bädda organ över natten med hjälp av en tissue-Tek VIP 3000 vävnad processor (Sakura Tek, Torrance, Kalifornien) och avsnitt i 5μm med hjälp av en Leica RM2255 microtone (Leica Microsystems, Bannockburn, Illinois).
3. Avvaxning sektioner
- Sänk avsnitt i en färgning tråg fyllt med tydliga-Rite för cirka 5 minuter så att alla vaxet att lösa upp. Lyft hyllan och dränera bort överflödigt vax lösningsmedel.
- Doppa delarna i en andra behållare med tydliga-rit i 5 minuter. Efter ett par användningar, ersätta lösningsmedel i den första behållaren och växla mellan första och andra behållare.
- Doppa delarna i 100% alkohol för att ta bort vaxet lösningsmedel.
- Doppa delarna i en andra tråg 100% alkohol.
- Doppa delarna i ett tråg med 70% alkohol.
- Sänk avsnitt i rinnande kranvatten för att avlägsna alla spår av alkohol.
4. Buffert förberedelse
- Förbered fosfatbuffrad koksaltlösning genom att lösa 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na 2 HPO 4 och 0,2 g KH 2 PO 4 till 1 liter destillerat vatten och pH till 7,4.
- Späd PBS till 0.9x genom att tillsätta 900 ml PBS till 100 ml destillerat vatten.
- Förbered blockering serum genom att tillsätta 2 ml mus serum, 200 l Triton-X 100 och 500 l BSA till 50 ml 0.9x PBS.
- Förbered 50 mM Bikarbonat saltlösning bereds genom att lösa 2,1 g NaHCO 3 och 4 g NaCl i 500 ml destillerat H 2 O och titreras till pH 8,2.
5. Immunhistochemistry
- Rehydrera sektioner genom nedsänkning i 0.9x PBS.
- Inkubera objektglasen i 30 minuter i blockerande serum.
- Inkubera avsnitt i Ed9 (utspädd 1 av 100 i blockera serum) i två timmar i en ogenomskinlig fuktig kammare vid rumstemperatur.
- Skölj avsnitt 4 gånger i PBS i 10 minuter vardera.
- Inkubera avdelningar för två timmar i 50 ìl av sekundär antikropp (get-anti mus FITC märkta antikroppar, utspätt 500 gånger för att blockera serum) i en ogenomskinlig fuktig kammare vid rumstemperatur.
- Skölj avsnitt 3 gånger i Bikarbonat saltlösning.
- Skölj avsnitt kortfattat i avjoniserat vatten.
6. Montering
- Låt objektglasen torka i mörker i några minuter.
- Montering sker med permafluor.
- Lämna monteringsmedium att torka, företrädesvis över natten, i en mörk sval miljö.
7. Mikroskop
- Histologisk sektioner är redo att observera under ett fluorescerande mikroskop. I vårt experiment använde vi ett Olympus BX51 mikroskop utrustat med en trippel (FITC, MCA Texas-Red) filter. I Picture Frame-programvara (MicroFire, Goleta) använts.
8. Representativa resultat:
Eftersom den automatiska fluorescens fiskvävnad är så hög, kommer dessa vävnader visas i orange i Tri-filtret, bekvämt att ge en bakgrund för bakterier.
Mot denna bakgrund kommer de enskilda FITC färgade bakterier visas som ljusa gröna prickar, och på 200X sitt spö form kommer att känna igen (Figur 1).
Bad sektioner kan utgöra falskt positiva (på grund av ett problem i sköljning fas), i vilket fall ett stort antal bakterier verkar finnas jämnt på bilden.
Figur 1. Mikroskop av en muskel sektioner som visar två E. ictaluri (pilar a och b) (200x).
igure 2 "/>
Figur 2. Övergripande system av experimentet
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll detaljer en teknik för in situ-visualisering av havskatt patogen Edwardsiella ictaluri i histologiska avsnitt. Så vitt vi vet är detta det första protokollet beskrivs.
Det mest kritiska steget i vår erfarenhet, är sköljning av antikroppar som beskrivs i steg 4.4 i detta protokoll som otillräcklig tvättning kan resultera i falskt positiva.
Det största problemet med att tolka resultaten med denna teknik är auto-fluorescens i vävnaden. Däremot fann man att använda Tri-filtret oftast löst det problemet som den stora majoriteten av de icke-specifika fluorescens inträffar utanför av det grönt fluorescerande spektrumet. Också, medan denna teknik är ganska känslig kan den misslyckas med att upptäcka låga bakteriell belastning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tolka tekniskt bistånd från Michelle Banes samt Dr Petrie-Hanson, Dr ålar och Timothy Brown för deras hjälp att utveckla och utföra immunohistokemi. Projektet har finansierats av USDA KRIS-projektet # MISV-0801310 och Mississippi State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
- Plumb, J. A. Fish Diseases and Disorders. Woo, P. T. K., Bruno, D. W. , CABI Publishing. New York. Vol. 3 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. Fish Pathology. , third ed, WB Saunders. (2001).
- Lawrence, M. L. Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W. Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G. L., Douglas, G. Jr, Bennett, J. E. , Vol 1 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
