Summary
ここではのラベル付けを可能にする手順を説明します。
Abstract
エドワードシエラ属ictaluriがチャネルナマズIctalurus punctatusの主要な病原体であり、1,2年近く前に三十年を発見してきたが、これまでのところ、これらの筆者の知る限りでは、メソッドはその場可視化のために開発されていない組織切片中の細菌。
細菌の局在が4、または生物発光細菌5というラベルの放射プレートカウント3を 、使用して、以前の研究で、生体内で決定されていますが、これらの研究のほとんどは、唯一の例外は6で、総臓器レベルで行われている。この制限は、E.ので特に懸念されるictaluriは、複雑な感染サイクル1,7を有し、そしてそれは、病原性因子8,9の様々なています。 E.の複雑な相互作用そのホストとictaluriは、同じ分類の家族になっているチフス菌10日に多くの点で似ています。
ここでは、エインズワースらにより記載されたモノクローナルEd9抗体を用いた間接免疫組織化学。11を使用して細菌の検出を可能にするテクニックを説明します。
簡単に言えば、ブロッキング血清は、非特異的bidingを防ぐために、パラフィン包埋組織切片に適用されます。 E.：次に、切片を一次抗体とインキュベートされていますictaluri特異的モノクローナル抗体Ed9。過剰な抗体は、すすぎされ、FITC標識二次抗体が追加されます。洗浄後、切片を蛍光特定の封入剤でマウントされています。
E.の検出のために許容されるこのブチナマズ組織の組織切片のin situでictaluri。
Protocol
1。細菌の挑戦
- 30で一晩細菌を培養する°ブレインハートインフュージョンブロスを振ってのC。
- 水槽内の水の循環を停止し、（リットル当たり10ml、たとえば）100分の1の濃度で培養液を追加します。
- 1時間のインキュベーション後に、残りの細菌を洗い流すためにタンク内の水の循環を再起動します。
2。サンプリング
- サンプリング時間や臓器は、研究の目的に依存しますが、我々の研究で、我々は次のサンプリングポイント使用：1、6、16、24、36、48、60、72、96、110、125および175時間後の感染を。
- 鰓、側線に沿って後部の筋肉、腸、脾臓、：各時点で、水を含むMS222とサンプルに浸漬することにより、次に掲げる機関を（サンプリングされた臓器の選択は感染の過程で知られているものに基づいていた）で6魚を安楽死させる肝臓、胃、心臓、頭の腎臓、およびトランクの腎臓。
- サンプリング時には、直ちに組織カセットに臓器をロードし、1％ホルマリン、2つの時間のためにそれらを浸す。
- 2時間固定した後、ホルマリンから彼らが埋め込みされるまで残っている50％エタノールにカセットを移す。
- パラフィンは、一晩組織- Tek社VIP 3000組織のプロセッサ（さくらテック、トーランス、カリフォルニア州）とライカRM2255微分音（ライカマイクロシステムズ、バノックバーン、イリノイ州）を用いて5μm以下でセクションを使用して臓器を埋め込む。
3。脱ろうセクション
- 溶解するすべてのワックスを可能にするために約5分間クリア儀式で満たされた染色トラフ内のセクションを浸し。ラックを持ち上げて、余分なワックスは溶剤切る。
- 5分間クリア儀礼の第二の容器内のセクションを浸し。いくつか使用した後、第一および第二の容器の間に第一の容器と代替溶媒を交換してください。
- 溶剤ワックスを除去する100％アルコールでセクションを浸し。
- 100％アルコールの第二の谷のセクションを浸し。
- 70％のアルコールの谷のセクションを浸し。
- アルコールのすべてのトレースを削除するには、水道水を流してのセクションを浸し。
4。バッファの準備
- リン酸塩が7.4に蒸留水とpHを1リットルに8.0グラムのNaCl、0.2グラムのKCl、1.15グラムのNa 2 HPO 4、0.2グラムのKH 2 PO 4を溶解することにより緩衝生理食塩水の準備。
- 100mlの蒸留水にPBSの900 mlを添加することにより0.9にPBSを希釈する。
- 2ミリリットルマウス血清を添加することにより血清ブロッキング準備、200μlのトリトンX - 100と0.9 PBS 50 mlに500μlのBSA。
- 50mMの重炭酸塩緩衝生理食塩水を500 mlの蒸留H 2 Oで2.1グラムNaHCO 3と4グラムのNaClを溶解し、pHを8.2に滴定することにより調製される準備をします。
5。 Immunhistochemistry
- 0.9 PBSで浸漬してセクションを再水和。
- 血清をブロッキングで30分間スライドをインキュベートする。
- 室温で不透明な湿室中で2時間Ed9（ブロッキング血清中で100に1希釈）でセクションをインキュベートする。
- 10分ごとにセクションをPBSで4回すすいでください。
- 室温で不透明な湿室で、二次抗体を50μlで2時間のセクションを（血清ブロッキングで500倍に希釈したヤギ抗マウスFITC標識抗体）インキュベートする。
- 重炭酸塩の3回緩衝生理食塩水のセクションをすすぐ。
- 脱イオン水で簡単にセクションをすすいでください。
6。取り付け
- 数分間暗闇の中で乾燥するためにスライドしておきます。
- 取付はpermafluorを使用して実行されます。
- 暗い涼しい環境では、優先的に一晩、乾燥する封入剤を残す。
7。顕微鏡
- 組織切片は蛍光顕微鏡下で観察する準備が整いました。フィルター、私たちの実験では、我々はトリプル（MCAテキサス - レッドFITC）を装備したオリンパスBX51顕微鏡を使用していました。フォトフレームのソフトウェア（MicroFire、ゴレタ、カリフォルニア州）を用いた。
8。代表的な結果：
魚組織の自家蛍光は非常に高いため、これらの組織は、便利な細菌のための背景を提供する、トライフィルタの下にオレンジ色が表示されます。
このような背景から、個々のFITC染色した細菌は、明るい緑色のドットとして表示されますと、200Xでそのロッドの形状が（図1）認識可能になります。
悪いのセクションでは、細菌の多数が一様にスライド上に存在するように見えますが、その場合には、（すすぎ段階に問題があるため）偽陽性を構成することができる。
図1二つのE.を示す筋肉切片の顕微鏡写真ictaluri（矢印aとb）（200倍）。
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図2実験の全体スキーム
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Discussion
このプロトコルの詳細組織切片のナマズ病原菌エドワードシエラ属ictaluriの in situ可視化のためのテクニック。我々の知る限り、これは説明する最初のそのようなプロトコルです。
最も重要なステップは、我々の経験では、偽陽性をもたらすことができるように不十分な洗浄として本プロトコールのステップ4.4に記載の抗体の洗浄です。
この手法の結果を解釈するの主な問題は、組織の自家蛍光である。しかし、それはトライフィルタを使用すると、ほとんどが非特異的蛍光の大部分として、問題は緑色の蛍光スペクトルの外で発生することが解決することがわかった。また、この手法は非常に敏感である一方、それは低い細菌の負荷を検出するために失敗することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は彼らの援助が開発し、免疫組織化学を行うための技術的なミシェルのバネスの援助だけでなく、博士ペトリ-ハンソン、博士のウナギとティモシーブラウンに感謝申し上げます。このプロジェクトは、米国農務省CRISプロジェクト＃MISV - 0801310によって獣医学のミシシッピ州立大学によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Infusion broth | BD Biosciences | 237200 | |
| MS222 | Argent Labs | ||
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 | |
| Goat anti-mouse FitC | SouthernBiotech | 1010-04 | |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma-Aldrich | S-9625 | |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S-9390 |
References
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