Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.
Abstract
Celpolariteit is een fundamentele eigenschap van eukaryote cellen die dynamisch wordt door zowel intrinsieke en extrinsieke factoren gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling 1, 2. Een van de signaalwegen betrokken bij deze verordening is de Wnt-route, die vele malen wordt gebruikt tijdens embryogenese en van cruciaal belang voor de mens de ziekte van 3, 4, 5. Meerdere moleculaire componenten van deze route coördinerend regelen signalering in een ruimtelijk-beperkte wijze, maar de onderliggende mechanismen zijn nog niet volledig begrepen. Xenopus embryo epitheliale cellen is een uitstekend systeem om subcellulaire lokalisatie van de verschillende signaleringeiwitten te bestuderen. TL-fusie-eiwitten worden uitgedrukt in Xenopus embryo's door RNA micro-injectie, zijn ectodermale explantaten voorbereid en eiwit lokalisatie wordt geëvalueerd door epifluorescentie. In deze experimentele protocol beschrijven we hoe de subcellulaire lokalisatie van Diversin, een cytoplasmatisch eiwit dat is betrokken bij signalering en celpolariteit vastberadenheid 6, 7 wordt gevisualiseerd in Xenopus ectodermale cellen Wnt signaaltransductie 8 te bestuderen. Co-expressie van een Wnt-ligand of een Frizzled receptor verandert de verdeling van de Diversin gefuseerd met rood fluorescerend eiwit, RFP en rekruten aan de celmembraan in een gepolariseerde mode 8, 9. Deze ex vivo protocol moet een nuttige aanvulling op in-vitro-studies van gekweekte zoogdiercellen, waarin ruimtelijke controle van signalering verschilt van die van de intacte weefsel en is veel moeilijker te analyseren is.
Protocol
1. In Vitro Fertilisatie van Xenopus Eieren Verkrijgen eitjes van vrouwelijke kikkers, dat met humaan choriongonadotrofine (400 unit / kikker) 12 uur ingespoten voor het experiment. Leg de eieren in een kleine hoeveelheid (0,5-1 ml) van een gemodificeerde Ringer-oplossing x Marc's (MMR) 10 om de eieren te bevruchten en ze in vitro met een klein stukje ontleed testis. Na 2-3 minuten, voeg dan 0,1 x MMR het hele oppervlak van de eieren te dekken. In 20 minuten…
Discussion
We hebben de boven-protocol om de subcellulaire lokalisatie van Diversin karakteriseren. In dierproeven pole explantaten, was Diversin-RFP naast de kern ontdekt en colocalized met g-tubuline, een centrosomal marker, in vriescoupes (figuur 1). Zodra de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is geïdentificeerd, kan verwijdering constructen gegenereerd worden om vast te stellen welk eiwit-domeinen zijn noodzakelijk en voldoende voor de subcellulaire lokalisatie. Met behulp van deze aanpak zijn de centrosomal lokalisatie …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in het Sokol laboratorium is gesponsord door de Nationale instituten of Health.
Itoh, K., Sokol, S. Y. Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling. J. Vis. Exp. (51), e2700, doi:10.3791/2700 (2011).