האאקטודרם Xenopus עובריים הפך מודל אטרקטיבי עבור מחקרים של הקוטביות בתא. Assay מתואר, שבה חלוקת subcellular של חלבוני ניאון נבחנת בתאים האאקטודרם. פרוטוקול זה יעזור כתובת לשאלות הקשורות שליטה מרחבית של איתות.
Abstract
הקוטביות Cell הוא מאפיין בסיסי של התאים האיקריוטים כי מוסדר באופן דינאמי במהלך ההתפתחות העוברית 1, 2 על ידי גורמים פנימיים וחיצוניים כאחד. אחד במעברי האותות המעורבים תקנה זו הוא מסלול ה-Wnt, אשר משמש פעמים רבות במהלך embryogenesis ו קריטי עבור מחלות אנושיות 3, 4, 5. רכיבים מולקולריים מרובות של מסלול זה מתואמת להסדיר איתות בצורה מרחבית מוגבלת, אבל המנגנונים אינם מובנים במלואם. Xenopus תאים עובריים אפיתל היא מערכת מצוינת ללמוד לוקליזציה subcellular של איתות חלבונים שונים. חלבונים היתוך פלורסנט באים לידי ביטוי על ידי עוברי Xenopus microinjection RNA, explants ectodermal מוכנים ולוקליזציה חלבון מוערך על ידי epifluorescence. בפרוטוקול זה ניסיוני אנו מתארים כיצד לוקליזציה subcellular של Diversin, חלבון cytoplasmic כי היה מעורב איתות הקוטביות בתא נחישות 6, 7 הוא דמיינו בתאים Xenopus ectodermal ללמוד התמרה האות Wnt 8. Coexpression של ליגנד Wnt או קולטן מסולסלת משנה את חלוקת Diversin התמזגו עם חלבון פלואורסצנטי אדום, RFP, ומגייסת אותו קרום התא באופן מקוטב 8, 9. זה פרוטוקול לשעבר vivo אמור להיות תוספת מועילה במבחנה של בתאי יונקים בתרבית, שבו השליטה במרחב של איתות שונה מזו של רקמת שלם הרבה יותר קשה לנתח.
Protocol
1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים השג ביצים צפרדעים נקבה כי הוזרקו גונדוטרופין כוריוני אנושי (400 יחידה / צפרדע) 12 שעות לפני הניסוי. מניחים ביצים לתוך כמות קטנה (0.5-1 מ"ל) של פתרון 1 x שונה ש…
Discussion
השתמשנו בפרוטוקול לעיל כדי לאפיין את לוקליזציה subcellular של Diversin. ב explants קוטב חיה, Diversin-RFP התגלתה ליד הגרעין colocalized עם טובולין-g, סמן centrosomal, ב cryosections (איור 1). לאחר לוקליזציה subcellular של חלבון מזוהה, בונה המחיקה יכול להיווצר להקים אילו תחומים החלבון הכרחי ומספיק לוקליזציה subcellu…
Itoh, K., Sokol, S. Y. Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling. J. Vis. Exp. (51), e2700, doi:10.3791/2700 (2011).