Gepolariseerde Translocatie van fluorescerende eiwitten in Xenopus Ectoderm in reactie op Wnt signalering

Summary

Xenopus embryonale ectoderm is uitgegroeid tot een aantrekkelijk model voor onderzoek van de cel polariteit. Een test wordt beschreven, waarin de subcellulaire distributie van fluorescerende eiwitten wordt beoordeeld in het ectoderm cellen. Dit protocol zal helpen met vragen met betrekking tot ruimtelijke controle van de signalering.

Abstract

Celpolariteit is een fundamentele eigenschap van eukaryote cellen die dynamisch wordt door zowel intrinsieke en extrinsieke factoren gereguleerd tijdens de embryonale ontwikkeling ^{1, 2.} Een van de signaalwegen betrokken bij deze verordening is de Wnt-route, die vele malen wordt gebruikt tijdens embryogenese en van cruciaal belang voor de mens de ziekte van ^{3, 4, 5.} Meerdere moleculaire componenten van deze route coördinerend regelen signalering in een ruimtelijk-beperkte wijze, maar de onderliggende mechanismen zijn nog niet volledig begrepen. Xenopus embryo epitheliale cellen is een uitstekend systeem om subcellulaire lokalisatie van de verschillende signaleringeiwitten te bestuderen. TL-fusie-eiwitten worden uitgedrukt in Xenopus embryo's door RNA micro-injectie, zijn ectodermale explantaten voorbereid en eiwit lokalisatie wordt geëvalueerd door epifluorescentie. In deze experimentele protocol beschrijven we hoe de subcellulaire lokalisatie van Diversin, een cytoplasmatisch eiwit dat is betrokken bij signalering en celpolariteit vastberadenheid ^{6, 7} wordt gevisualiseerd in Xenopus ectodermale cellen Wnt signaaltransductie ⁸ te bestuderen. Co-expressie van een Wnt-ligand of een Frizzled receptor verandert de verdeling van de Diversin gefuseerd met rood fluorescerend eiwit, RFP en rekruten aan de celmembraan in een gepolariseerde mode ^{8, 9.} Deze ex vivo protocol moet een nuttige aanvulling op in-vitro-studies van gekweekte zoogdiercellen, waarin ruimtelijke controle van signalering verschilt van die van de intacte weefsel en is veel moeilijker te analyseren is.

Protocol

1. In Vitro Fertilisatie van Xenopus Eieren

1. Verkrijgen eitjes van vrouwelijke kikkers, dat met humaan choriongonadotrofine (400 unit / kikker) 12 uur ingespoten voor het experiment.
2. Leg de eieren in een kleine hoeveelheid (0,5-1 ml) van een gemodificeerde Ringer-oplossing x Marc's (MMR) ¹⁰ om de eieren te bevruchten en ze in vitro met een klein stukje ontleed testis. Na 2-3 minuten, voeg dan 0,1 x MMR het hele oppervlak van de eieren te dekken. In 20 minuten wordt ei gelei coat verwijderd met 3% cysteine ​​- HCL (pH 8 met natrium hydroxide). Eieren zijn gewassen met 0,1 x BMR drie keer en liet in een koude incubator (13 ° C) voor injecties.
3. Bevruchte eieren mogen ontwikkelen tot 2-4 cellig stadium. Voor injecties, worden de embryo's overgebracht naar de oplossing van 3% Ficoll, 0,5 x MMR.

2. RNA micro-injectie

1. RNA's worden gesynthetiseerd uit gelineariseerde DNA-templates met behulp van mMessage mMachine kit (Ambion) en verdund met RNase-vrij water op de beurs concentratie van 0,1-1 ug / ul. Optimale doses van RNA's voor injecties worden bepaald in pilot experimenten. RNA's voor Diversin-RFP, het membraan marker GFP-CAAX en Frizzled 8 worden gebruikt bij 0,1 tot 1 ng per injectie.
2. Injectienaalden worden bereid met een naald trekker van een capillair en vervolgens met een naald molen. Voor de injectie wordt elke naald gekalibreerd met water tot 10 nl van de vloeistof per injectie uit te werpen.
3. Voor injecties, worden embryo's geplaatst op een plastic schaaltje in een grote druppel van 3% Ficoll, 0,5 x MMR. Een microliter van RNA-oplossing is meegezogen in een injectienaald met Narishige microinjector. 10 nl van RNA wordt geïnjecteerd in dier blastomeren van 8 cellige embryo 2-3 keer. De geïnjecteerde embryo's worden omgezet in een goed van de 12-well plaat.

3. Voorbereiden ectodermale Explantaten

1. Wanneer de geïnjecteerde embryo's vroeg gastrulastadium te bereiken, worden ze overgebracht naar 0,6 x MMR-oplossing in een 3 cm plastic schaal bedekt met 1% agarose. Vitelline membraan wordt handmatig verwijderd met een pincet. Ectodermale explantaten zijn uitgesneden uit de embryo's met behulp van een naald en een Tungsten hairloop.
2. Ectodermale explantaten worden overgebracht in een glazen flacon en gefixeerd met 3,7% formaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 30 minuten. Vaste explantaten zijn gewassen met PBS drie keer (10 minuten). DAPI is opgenomen in de derde maal naar kernen vlek.
3. Explantaten zijn gemonteerd op een dia glas. Twee stroken plakband zijn aan de dia en de explantaten worden geplaatst tussen de twee stroken. Sinds de buitenkant van explantaten is gepigmenteerd, moet de binnenzijde van de explantaten het gezicht van de microscoop doelstelling. Voeg twee tot drie 20 pl druppels van de montage-oplossing (70% glycerol in PBS met 25 mg / ml DABCO, anti-fading reagens) ^11. Leg een dekglaasje op de top.

4. Beeldvorming van Explantaten Onder een fluorescentiemicroscoop

1. Monsters worden bekeken onder Zeiss Axioplan fluorescentie microscoop met passende filters.
2. Beelden worden genomen met de apotome gehechtheid aan een bepaald vliegtuig uit verschillende onafhankelijke explantaten te visualiseren.

5. Cryosectioning

Cryosectioning is een alternatieve manier om de verdeling van fluorescerende eiwitten in de cel en meer van toepassing voor immunokleuring visualiseren. In fase 10, zijn embryo's die voor 1-2 uur met een fixatief Dent's (20% DMSO, 80% methanol), gewassen met PBS, en ingebed in 15% vis gelatin/15% sucrose-oplossing ^11. Het embedded embryo's worden snel ingevroren op droog ijs en vriescoupes worden gegenereerd op Leica Cryostaat. Doorsneden zou omvatten ectodermale cellen die ingespoten RNA's en hun vertaalde eiwitproducten erven. De secties behouden fluorescentie en kan worden immunostained met specifieke antilichamen en vervolgens gemerkt met secundaire antilichamen geconjugeerd met fluorescentie. Kernen zijn gekleurd met DAPI. De montage media zijn dezelfde als hierboven beschreven. Beeldvorming kan worden uitgevoerd zoals hierboven beschreven.

6. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Frizzled receptor rekruten Diversin aan het celmembraan. Ectoderm cellen die Frizzled 8 (Xfz8) en Div-RFP RNA's onthullen Div-RFP op het celmembraan, in plaats van het centrosoom (zoals blijkt uit g-tubuline co-kleuring). De regeling van het experiment is aan de top, een typische doorsnede wordt getoond.

Discussion

We hebben de boven-protocol om de subcellulaire lokalisatie van Diversin karakteriseren. In dierproeven pole explantaten, was Diversin-RFP naast de kern ontdekt en colocalized met g-tubuline, een centrosomal marker, in vriescoupes (figuur 1). Zodra de subcellulaire lokalisatie van een eiwit is geïdentificeerd, kan verwijdering constructen gegenereerd worden om vast te stellen welk eiwit-domeinen zijn noodzakelijk en voldoende voor de subcellulaire lokalisatie. Met behulp van deze aanpak zijn de centrosomal lokalisatie domeinen van Diversin is toegewezen aan het midden en in het carboxy-terminale domeinen van het eiwit, zowel met de coiled-coil motief ^8.

Hetzelfde protocol kan gebruikt worden in studies, in welk eiwit lokalisatie is veranderd in reactie op signalering. We vonden dat Wnt uitgescheiden eiwitten te handelen Div-RFP verhuizen naar punctata structuren grenzend aan de celmembraan, terwijl FZ8 werft Div-RFP naar cel membraan patches (figuur 1). We hebben verder ontdekt dat de carboxy-terminale domein niet essentieel is voor het membraan werving per se, maar die nodig zijn voor gepolariseerde membraan recruitment.

Samengevat zal de bovenstaande experimenteel protocol te helpen in diverse studies van eiwit-eiwit interacties en eiwit lokalisatie van verschillende cellulaire compartimenten na stimulatie van de cellen met specifieke groeifactoren of signalering eiwitten.