Polariserade flyttning av fluorescerande proteiner i Xenopus Ektoderm som svar på Wnt Signaling

Summary

Xenopus embryonala ektoderm har blivit en attraktiv modell för studier av cellens polaritet. En analys beskrivs, där subcellulära distribution av fluorescerande proteiner bedöms i ektoderm celler. Detta protokoll kommer att hjälpa behandla frågor rörande fysisk kontroll av signalering.

Abstract

Cell polaritet är en grundläggande egenskap hos eukaryota celler som dynamiskt regleras av både endogena och exogena faktorer under fosterutvecklingen ^{1, 2.} En av de signalvägar involverade i denna förordning är Wnt väg, som används många gånger under fosterutvecklingen och kritiska för mänskliga sjukdomar ^{3, 4, 5.} Flera molekylära komponenter i denna väg reglera coordinately signalering i ett rumsligt fritt sätt, men de bakomliggande mekanismerna är inte helt klarlagda. Xenopus embryonala epitelceller är ett utmärkt system för att studera subcellulära lokalisering av olika signalsystem proteiner. Fluorescerande fusionsproteiner uttrycks i Xenopus embryon genom RNA mikroinjektion, är ektodermal explants förberedda och protein lokalisering utvärderas av epifluorescence. I denna experimentella protokoll beskriver vi hur subcellulära lokalisering av Diversin, en cytoplasmiska protein som har varit inblandad i signalering och cell polaritet beslutsamhet ^{6, 7} visualiseras i Xenopus ektodermal celler för att studera Wnt signaltransduktion ^8. Coexpression av Wnt ligand eller en krulliga receptor förändrar fördelningen av Diversin smält med röda fluorescerande proteinet, RFP och rekryter till cellmembranet i ett polariserat sätt ^{8, 9.} Detta ex vivo protokoll bör vara ett användbart komplement till in vitro-studier av odlade däggdjursceller, där rumsliga kontrollen av signalering skiljer sig från den intakta vävnaden och är mycket svårare att analysera.

Protocol

1. In vitro befruktning av Xenopus Ägg Skaffa ägg från kvinnliga grodor som injicerades med humant koriongonadotropin (400 enheter / groda) 12 timmar före försöket. Placera äggen i en liten mängd (0,5-1 ml) av en modifierad x Marcs Ringer-lösning (MMR) 10 till äggen och befruktar dem in vitro med en liten bit av dissekeras testiklarna. Efter 2-3 minuter, tillsätt 0,1 x MMR att täcka hela ytan av äggen. På 20 minuter är ägget gelé päls …

Discussion

Vi har använt ovan nämnda protokollet för att karakterisera subcellulära lokalisering av Diversin. I explants djur pol, var Diversin-RFP upptäckt intill kärnan och colocalized med G-tubulin, ett centrosomal markör i kryosnitt (figur 1). När subcellulära lokalisering av ett protein som identifierats kan radering konstruktioner skapas för att fastställa vilket protein domäner är nödvändiga och tillräckliga för subcellulära lokalisering. Med hjälp av denna metod har centrosomal lokalisering domäner Dive…