Ectodermo embrionario de Xenopus se ha convertido en un atractivo modelo para el estudio de la polaridad celular. Un ensayo se describe, en el que la distribución subcelular de las proteínas fluorescentes se evalúa en las células de ectodermo. Este protocolo ayudará a contestar preguntas relacionadas con el control espacial de la señalización.
Polaridad celular es una propiedad fundamental de las células eucariotas que es dinámica regulada por factores tanto intrínsecos como extrínsecos durante el desarrollo embrionario de 1, 2. Una de las vías de señalización implicadas en el presente Reglamento es la vía Wnt, que se utiliza muchas veces durante la embriogénesis y la crítica de la enfermedad humana 3, 4, 5. Múltiples componentes moleculares de esta vía de señalización de forma coordinada regular de manera espacialmente restringida, pero los mecanismos subyacentes no se comprenden totalmente. Xenopus células epiteliales embrionarias es un excelente sistema para estudiar la localización subcelular de las diferentes proteínas de señalización. Las proteínas fluorescentes de fusión se expresan en los embriones de Xenopus por microinyección de ARN, los explantes ectodérmica se preparan y localización de la proteína es evaluada por epifluorescencia. En este protocolo experimental se describe cómo la localización subcelular de Diversin, una proteína citoplasmática que se ha implicado en la señalización celular y la determinación de la polaridad de 6, 7 se visualiza en Xenopus células ectodérmicas para estudiar la transducción de señales Wnt 8. Co-expresión de un ligando Wnt o un receptor Frizzled altera la distribución de Diversin fusionada con la proteína fluorescente de color rojo, RFP, y recluta a la membrana celular de una manera polarizada 8, 9. Este protocolo ex vivo debe ser una adición útil a los estudios in vitro de células de mamífero cultivadas, en el que el control espacial de la señalización difiere de la del tejido intacto y es mucho más difícil de analizar.
Hemos utilizado el protocolo anterior para caracterizar la localización subcelular de Diversin. En los explantes de polo animal, Diversin-RFP se detectó al lado del núcleo y colocalized con g-tubulina, un marcador centrosomal, en cryosections (Figura 1). Una vez que la localización subcelular de una proteína se identifica, supresión construcciones se pueden generar para establecer dominios de la proteína que son necesarias y suficientes para la localización subcelular. Con este enfoque, los dominios de la locali…
The authors have nothing to disclose.
Investigación en el laboratorio Sokol es patrocinado por el institutos agregados Nacional de Salud.