Summary
保守的胰岛素信号通路在果蝇中发现
Abstract
保守的营养感应机制之间存在着哺乳动物和果蝇肽类似哺乳动物的胰岛素和胰高血糖素，分别在幼虫阶段发育1,2维持血糖平衡的功能。主要有丝分裂后的成年果蝇的研究发现扰动糖代谢的胰岛素生产细胞（IPCS）3样肽（ILP）的遗传消融的结果。因此，成年果蝇保持一个合适的代谢紊乱，包括II型糖尿病的遗传模型系统的巨大潜力。为了进一步发展果蝇系统，用于测量哺乳动物糖耐量和胰岛素敏感性的可比生理检测，必须建立。为此，我们最近测量口服葡萄糖容忍的反应在成人飞介绍一种新的程序，并表现出成人的IPC的重要性，在维持血糖稳态4,5。在这里，我们已经修改为先前所描述的胰岛素注射6的程序，并结合血淋巴中提取了一种新的方法来测量在成人飞周围胰岛素敏感性。与众不同的是，我们的协议允许成年果蝇的能力，处置周边葡萄糖负荷时注射胰岛素的方法，使胰岛素信号突变和影响成人飞糖耐量和胰岛素敏感性的潜在干预是可行的特点直接的生理测量。
Protocol
1。胰岛素溶液的制备
- 准备新鲜牛胰岛素溶液溶解在PBS中的胰岛素，达到0.01毫克/毫升的浓度。胰岛素/ PBS和控制PBS解决方案必须保持整个注射过程中的冰。这些解决方案应与0.5％（V / V）FD＆C蓝色没有准备。 1食品着色剂。
2。针的制备和注射设置
- 使用一个车夫设置产生足够的质量针注射微量puller.The：热火，345;拉，210;速度，100;时间，200（100毫秒），准备毛细玻璃针。刚拉的针，必须按提示通过Kimwipe组织减弱。这钝化过程中删除拉长的高抗尖和，产生一个具有较大孔径的stouter提示。
- 将钝的针头，针尖在含有微量胰岛素/ PBS溶液或PBS管。在回填土每针毛细管行动的结果。观察，立体显微镜下，以确保无杂物或气泡出现在提示的针尖。放弃任何针头不干净填写。
- 插入一个装满针的显微，使针尖通过立体显微镜下可见成手动微量持针器和位置的持针器。应用正压液柱针转动的手动微量微量注射器柱塞的千分尺旋钮。
- 验证流体位移足够的压力，已应用于通过触摸一个Kimwipe针尖和确认流体流动。
- 一旦针头已准备注射，贴上一个校准图表针轴与透明胶带，并带来20倍的放大倍率下通过体视显微镜的针尖成为焦点。
3。粉煤灰制备
- 10天岁的雌性果蝇用于注射实验。羽化24小时内收集的苍蝇。麻醉与加湿的CO 2气体盘，整理出含有小瓶标准或治疗饮食的男性和雌性果蝇的地方苍蝇。维持10天的雌性果蝇实验的饮食。
- 在羽化和分离实验的饮食后的第十天，转让苍蝇从他们的食物含瓶小瓶5毫升含有2％的琼脂插件，饿死他们为12-16小时。
- 小瓶含10％葡萄糖注射胰岛素前1小时浸泡过滤器传输饿死的苍蝇。
- 简言之麻醉与加湿的CO 2的苍蝇葡萄糖喂养后，再用冷水固定在冰上。
4。注射过程
- 轻轻抓住冷固飞与一双细镊子，并保持它靠近针尖，使针尖飞的胸部左侧前地区毗邻。纳入重点下的体视显微镜的针尖和果蝇的胸部。
- 轻轻移动飞朝针尖，使针尖触及左飞的胸部（图1）prescutum地区突起的中心。一旦飞是正确导向，对准针尖，继续推进到飞针，使针头刺穿prescutum中心。
- 应用积极的压力，需要通过推进注射器柱塞微量的显微操纵器旋钮，直到成飞已注入0.1μL液。成飞的hemocoel流体的流动将传授蓝色前胸部的左侧。有时，必须收回，提前多次驱逐任何针头堵塞，使流体流动。
- 允许注入果蝇血淋巴中提取前指定的时间点恢复2％琼脂小瓶。
5。淋巴收集
- 简要麻醉与加湿的CO 2所需的注射后的时间点和位置苍蝇每飞，背端的CO 2垫表面贴双面胶带。安排在偶数行头对齐胶囊苍蝇。我们可以使用一个镶着木涂药棒到磁带粘合剂按它们的翅膀，并确保固定。
- 一旦苍蝇固定到磁带上，把握每一个飞行的长鼻，用细镊子，轻轻一拉，对腹，然后后区飞使头舱的前方是通过立体显微镜可见。
- 用另一只手按住的长鼻位置，穿刺中心的正上方ptilinal缝合头部胶囊，使用锋利的钨针（图2）。我们必须注意不要插入针太远，因为它很容易打穿头舱的另一侧针尖，随后失去彗星ontrol流的血淋巴。穿刺所有苍蝇之前收集血淋巴注射组。
- 一旦被刺破头囊，使用修整木涂药棒轻轻施加压力，以苍蝇的腹部。它推出过这样的飞行，它在其腹侧在于你施加压力可能会有所帮助。此过程会产生从头部囊穿刺部位的血淋巴中的液滴。
- 触摸一个加入1μlmicrocapillary管从头部囊穿刺部位出现血淋巴液滴的一端。将通过毛细作用进入血淋巴管。确定并记录通过检查microcapillary管内液柱对一个毕业于量图表收集血淋巴量。
6。淋巴葡萄糖测定
- 弹出到微孔板含100μL无限葡萄糖试剂的血淋巴样品。板，而加载血淋巴样品置于冰上。
- 50MM，25MM，12.5MM，6.25mM和3.125mM分别装载葡萄糖储备液各1μL，建立标准曲线。
- 孵育样品在37 ° C下10分钟。
- 检测在340 nm处的吸光度。
- 收集血淋巴量的帐户，并确定样品中葡萄糖浓度的基础上，与已知的血糖浓度的标准曲线。
7。代表性的成果
一个典型的胰岛素耐受反应检测胰岛素注射循环中的葡萄糖水平下降是检测到注射后15分钟的苍蝇。相比之下，这样的反应是没有看到在PBS注入果蝇（图3）。飞起来，注射后30分钟，这在周边葡萄糖处置的响应，继续在胰岛素注射。我们经常提取每4-5苍蝇在每次注射组0.2-0.5微升血淋巴。三注射组包括在每一个实验。
图1。果蝇表现出针插入部位（从Demerec，1950年修订）7胸部的左侧。通过prescutum前，左侧胸廓的背地区的中心插入针。
图2显示穿刺血淋巴中提取的位置（从Demerec，1950年修订）7的果蝇的正面观。刺头细削尖的钨探针在中心的正上方ptilinal缝合头胶囊胶囊。
图3，一个典型的胰岛素耐受反应检测控制成人苍蝇。 1118苍蝇控制瓦特注射牛胰岛素的PBS（1毫微克）或PBS。复制组中的苍蝇，然后让其恢复为0，15或30分钟，循环血糖水平进行了测量。
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Discussion
在本报告中描述的技术在任何调查在果蝇血淋巴成分的检测的改变导致生理过程的研究，是潜在有用的。通过以这种方式相结合的注射和血淋巴收集，它是可能的，以确定一个特定的实验性治疗或操纵的切身有关生理影响。这种“放血”技术的主要优点是收集超过以前的技 术，涉及斩首 2血淋巴，这种技术最大限度地减少污染血淋巴样品与肠道contents.If护理是不收取任何pericerebral脂肪体组织，这有时可能会出现在渗出血淋巴液滴，然后样品应准确地反映了在体内循环液的状态。
在这个规模进行任何注射实验中所固有的一个潜在的混杂因素的总循环液，注射后的初始稀释。这可以很容易地得到控制，但是，通过注入年龄匹配的对照实验苍蝇或胰岛素相同的PBS卷和规范结果。要确保重现循环血糖，血淋巴滴的质量是最重要的。应收集血糖测定血淋巴缺乏pericerebral脂肪体或其他组织碎片只有明确的水滴。同样值得注意的是，最多只有8个样本收集前应确定相对的血糖浓度。我们注意到，在外径340的血淋巴样品时，在冰上留下一个很长一段时间的读数“漂移” 。
我们的协议，使现有设备的基础上进行修改的余地。吸取拉马设置，可能需要进行修改的基础上的模型和拉马的条件。我们发现，设置足够的用于生产的细胞内记录电极针注射针头的理想选择。此外，虽然我们采用三个轴的显微操纵器，为保持针下的立体位置，这也可能达到一个坚固的ringstand和夹紧系统的针仍然在整个注射过程中的一个固定位置。针的高电阻使用需要确定注射液的体积为1:1注射器推杆运动位移量是无法实现的另一种方法的发展。我们开发了可打印针轴两侧的刻度。根据在系统上使用，它可能是必要的，以取代针持针器超出的微量流体，使流体的半月板可能与刻度对齐校准卡贴针轴的一侧。
最后，这种技术的局限性，指出在我们的协议。首先，两个人通常需要协调注射液和血淋巴中提取的步骤，以最大限度地处理的样品数量。其次，在胰岛素耐受反应的变化，有时在同一基因型观察。我们相信这是由于变量的反应，个别苍蝇可能有以下固定冰和琼脂恢复。因此，足够数量的样品应当审查之前，可以得出可靠的结论。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是从NIA的YW.CF（AG21068，AG31086）的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
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