Summary
보존 인슐린 신호 전달은 과일 파리에서 찾은 경로
Abstract
보존 영양 감지 메커니즘은 펩티드가 발달 애벌레 단계 1,2 중에 포도당 항상성을 유지하기 위해 각각 포유류의 인슐린과 글루카곤, 기능과 유사한 포유류와 과일 날아 사이에 존재합니다. 대부분 사후 mitotic 성인 파리에서 연구가 세포 (IPCs) 3를 생산 인슐린과 같은 펩티드 (ILP)의 유전자 절제의 결과로 포도당 항상성의 섭동을 공개했습니다. 따라서 성인 과일 파리 2 형 당뇨병을 포함하여 신진 대사 장애에 적합한 유전자 모델 시스템으로 큰 약속을 잡아. 추가로 과일 파리 시스템을 개발하려면, 포유류에서 포도당 내성과 인슐린 민감도를 측정하는 데 사용되는 비교 생리학 assays 설립해야합니다. 이를 위해, 우리는 최근 성인 비행에 경구 포도당 내성 응답을 측정하는 소설 절차를 설명하고 포도당 항상성은 4,5 유지 성인 IPCs의 중요성을 보여주었다. 여기, 우리는 인슐린 주사 6 이전에 설명한 절차를 수정하고 성인 비행의 말초 인슐린 민감도를 측정하는 소설 hemolymph 추출 방식으로 결합합니다. 유니 클리 우리 프로토콜은 인슐린 주사, 인슐린 신호 돌연변이 성인 비행에서 포도당 내성과 인슐린 민감도에 영향을 미치는 잠재적인 개입을 특징으로이 가능하게 방법론에 주변 포도당 부하를 처리하는 성인 비행 능력의 직접적인 생리적 측정이 가능합니다.
Protocol
1. 인슐린 솔루션 준비
- 0.01 MG / ML의 농도를 달성하기 위해 PBS에 인슐린을 용해하여 새로운 소 인슐린 솔루션을 준비합니다. 인슐린 / PBS 및 제어 PBS 솔루션 모두 사출 절차를 통해 얼음에 보관해야합니다. 이러한 솔루션은 0.5 % (V / V) FD & C 블루 번호와 함께 준비한다. 1 식용 색소.
2. 니들 준비 및 설정 사출
- ; 당겨, 210, 속도, 100, 시간, 200 (100ms) 열, 345 : 풀러 설정이 주사에 대한 충분한 품질의 바늘을 생산 따라 micropipette puller.The를 사용하여 모세관 유리 바늘을 준비합니다. 갓 뽑아 바늘은 Kimwipe 조직을 통해 팁을 눌러 무딘해야합니다. 이 둔화 과정은 길쭉한 높은 저항 팁을 제거하고 큰 기공 직경 stouter 팁을 생산하고 있습니다.
- 팁 - 최대 인슐린 / 혼자 PBS 용액 또는 PBS를 포함하는 microcentrifuge 관에 무딘 바늘을 놓으십시오. 각 바늘의 백업 작성의 작업 결과를 모세. 더 파편이나 공기 방울이 끝에 표시되지 않도록 stereomicroscope 아래 바늘의 팁을 관찰. 정상적으로 입력되지 않은 바늘 폐기하십시오.
- 바늘 끝이 stereomicroscope를 통해 볼 수 있도록 micromanipulator로 수동 microinjector 니들 홀더 및 위치 바늘 홀더에 가득 바늘을 삽입합니다. microinjector의 주사기에 플런저에 연결된 수동 microinjector 마이크로 미터 손잡이를 돌려하여 바늘의 유체 열을 긍정적인 압력을 적용합니다.
- 유체 변위 위해 충분한 압력을 확인은 바늘 끝에 Kimwipe를 감동 유체 흐름을 확인하여 적용되었습니다.
- 일단 바늘이 부착 분명 테이프와 바늘 샤프트로, 분사에 대한 보정 차트 준비하고, 20X 배율 아래 stereomicroscope을 통해 초점에 바늘 끝을 가지고있다.
3. 준비 플라이
- 텐 일 된 암컷 파리는 분사 실험에 사용됩니다. eclosion 24 H 내에 파리를 수집합니다. 남성 여성과 장소 파리가 밖으로 표준 또는 치료 식단을 포함 유리병에 가스 패드에 humidified CO 2, 정렬과 함께 파리를 마취. 10 일간 실험 다이어트에 대한 여성의 파리를 유지합니다.
- 실험 다이어트에 eclosion 분리 다음 열째 날, 송금은 2 % 한천의 5 ML 플러그인을 포함하는 튜브 자신의 음식을 함유 튜브에서 파리와 12-16 H. 그들을 굶어
- 인슐린 주입하기 전에 1 시간 10 % 포도당 젖었 필터를 포함하는 튜브에 굶주려 파리를 전송합니다.
- 간단히 포도당 수유 후 humidified CO 2와 함께 파리를 마취 후 차가운 얼음에 그들을 고정.
4. 사출 절차
- 부드럽게 잘 포셉 한 쌍의와 추위에 고정 비행을 파악하고 끝은 파리의 흉부의 왼쪽의 앞쪽에 지역에 인접한 있도록 그것은 바늘 끝 가까이에 잡아. stereomicroscope 아래의 초점에 바늘 끝과 파리의 흉부를 모두 가져와.
- 바늘 끝이 파리의 흉부 (그림 1)의 왼쪽 prescutum 지역의 융기의 중심을 접촉 있도록 부드럽게 바늘 끝쪽으로 날아 이동합니다. 파리가 올바르게 지향하고 바늘 끝에 부합되면, 바늘은 prescutum의 중심을 impales 있도록 바늘에 비행을 사전에 계속.
- 유체의 0.1 μl가 비행에 주입되어 때까지 microinjector의 micromanipulator 손잡이와 주사기의 플런저를 발전하여 필요에 따라 긍정적인 압력을 적용합니다. 파리의 hemocoel로 유체의 흐름은 앞쪽에 흉부의 왼쪽에 파란색을 가르친다합니다. 때때로 하나는 취소 및 바늘 팁 차단을 이동시키다 및 유체 흐름 수 있도록 여러 번 사전해야합니다.
- 주입 파리 hemolymph 추출하기 전에 지정된 시간이 지점에 대한 2 % 한천 튜브 안에 복구하도록 허용합니다.
5. Hemolymph 컬렉션
- 간단히 원하는 사후 분사 시간 지점과 위치에 humidified CO 2와 함께 파리를 마취 등의 사이드 다운 CO 2 패드의 표면에 부착된 양면 테이프의 각 비행. 정렬 헤드 캡슐도 행으로 파리를 마련. 하나는 테이프 접착제로 자신의 날개를 눌러 고정을 위해 손질 나무 작은 주걱 스틱을 사용할 수 있습니다.
- 일단 파리가 테이프로 고정 좋은 포셉 각 비행의 코을 파악하고 머리 캡슐의 앞에는 스테레오 현미경을 통해 볼 수 있도록 부드럽게 비행의 후부 다음 복부 및 지역으로 그것을 끌어 수 있습니다.
- 다른 손과 위치에 코를 들고 있지만, 펑크 단지 ptilinal 봉합 위의 헤드 캡슐의 중심은 날카로운 텅스텐 바늘 (그림 2)를 사용. 그것이 머리를 캡슐 반대편을 통해 바늘의 팁을 펀치와 이후 C를 잃고 쉽게로서 하나는 너무 멀리 바늘을 삽입하지 않도록주의해야합니다hemolymph 흐름 ontrol. 찔린 모든 hemolymph를 수집하기 전에 사출 그룹에 날아갑니다.
- 머리 캡슐가 구멍되면 부드럽게 파리의 복부에 압력을 적용하는 손질 나무 작은 주걱 스틱을 사용합니다. 그것은 당신이 압력을 적용으로는 복부 측면에 붙어 있도록 동안 파리를 롤 도움이 될 수 있습니다. 이 절차는 머리 캡슐 찔린 사이트에서 hemolymph의 비말을 생산합니다.
- 머리 캡슐 찔린 사이트에서 신흥 hemolymph 비말에 1μl microcapillary 튜브의 한쪽 끝을 터치. hemolymph는 모세관을 통해 튜브를 입력합니다. 졸업 볼륨 차트에 대한 microcapillary 튜브 내의 유체 열을 선택하여 수집한 hemolymph의 양을 확인하고 기록합니다.
6. Hemolymph 포도당 결정
- microplate 우물은 무한 포도당 시약 100 μl를 포함하는으로 hemolymph 샘플을 추출. hemolymph 샘플을로드하는 동안 얼음 접시 보관하십시오.
- 50mM, 25mM, 12.5mM, 6.25mM과 3.125mM에서 별도로 1 μl 포도당 주식 솔루션의 각로드하여 표준 곡선을 설정합니다.
- 37 샘플을 품어 ° C를 10 분.
- 340 nm의 흡광도에서 감지.
- hemolymph 볼륨에 대한 계정을 수집하여 알려진 포도당 농도와 표준 곡선에 따라 샘플 포도당 농도를 결정한다.
7. 대표 결과
전형적인 인슐린 내성 반응은 포도당 수준을 순환의 드롭 15 분 후 주사를 감지 인슐린 주입 파리에서 감지됩니다. 대조적으로, 이러한 반응은 PBS 주입 파리 (그림 3)을 볼 수 없습니다. 주변 포도당 처리에서이 반응은 인슐린 주입에 계속 삼십분 이후 주사까지 날아. 우리는 정기적으로 각 사출 그룹에 4-5 파리 당 hemolymph의 0.2-0.5 μl 압축을 풉니다. 세 사출 그룹은 각 실험에 포함되어 있습니다.
그림 1. 주사 바늘을 삽입 사이트 (Demerec 1950에서 수정) 7를 보여주 Drosophila의 흉부의 왼쪽 측면. 흉부의 왼쪽의 앞쪽에, 등의 지역에 prescutum의 중심을 통해 바늘을 삽입합니다.
그림 2. hemolymph 추출 (Demerec 1950에서 수정) 7 바늘 위치를 보여주는 Drosophila 머리의 전두엽 볼 수 있습니다. 찔린 단지 ptilinal 봉합 위의 헤드 캡슐의 중심에 가늘게 날카롭게 텅스텐 탐침과 함께 머리를 캡슐.
그림 3. 컨트롤 성인에서 검색된 전형적인 인슐린 내성 응답이 빠르다. 컨트롤 w 1118 파리는 소 인슐린 (PBS 1 NG) 또는 PBS에만 주입했다. 복제 그룹에 날아 그 다음 0, 15 또는 30 분 순환 포도당 수준 복구할 수 있었다 것은 측정했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 보고서에 설명된 기술은 Drosophila의 hemolymph 구성에 감지 변경의 결과로 생리 과정을 조사하는 연구에서 잠재적으로 유용합니다. 이러한 방식으로 주입하고 hemolymph 컬렉션을 결합함으로써, 특정 실험 치료 또는 조작의 즉각적인 생리학 관련 효과를 확인할 수 있습니다. 잘린 2와 관련된 이전의 기술을 통해 hemolymph 수집이 "방혈"기술의 주요 장점은 직감 contents.If 치료가 때로는에 나타날 수있는 pericerebral 지방 신체 조직을 수집하지 않도록합니다이 기술은 hemolymph 샘플의 오염을 최소화있다 hemolymph 비말을 exuded 다음 샘플 정확하게 생체내 순환 유체의 상태를 반영해야합니다.
이 규모에서 수행하는 주입 실험에 내재된 잠재적으로 혼란함을 주죠 요인은 다음과 같은 사출 총 순환 유체의 초기 희석입니다. 이것은 쉽게 나이와 일치하는 컨트롤에 실험 비행이나 인슐린에 PBS 같은 볼륨을 주입하고 결과를 정규화하여 그러나를 위해 조절할 수 있습니다. 재현성 순환 포도당 수치를 위해, hemolymph의 방울의 품질이 가장 중요하다. pericerebral 지방 신체 또는 기타 조직 파편 찾아볼 수 hemolymph만이 명확 방울은 포도당 결정에 대해 수집해야합니다. 그것은 오직 최대 8 샘플 상대적인 포도당 농도를 결정하기 전에 수집해야한다고도 주목할만한 것입니다. 우리는 hemolymph 샘플은 오랜 시간 동안 얼음에 남아 있었다 OD 340 판독에 "표류"를 발견했습니다.
우리의 프로토콜을 사용할 장비에 따라 변형에 대한 많은 공간을 떠납니다. Pipet의 풀러 설정은 풀러의 모델과 조건에 따라 수정해야 할 수 있습니다. 우리는 세포내 기록 전극 침 생산을위한 적절한 설정이 주입 바늘에 이상적입니다 것으로 나타났습니다. 우리가 입체경 아래의 바늘 위치를 유지하기위한 3 축 micromanipulator를 고용하는 동안 바늘이 주입 절차 전반에 걸쳐 고정된 위치에 남아로서 또한, 이것은 또한 튼튼한 ringstand 및 클램프 시스템을 구현할 수 있습니다. 바늘의 높은 저항은 볼륨 변위에 1:1 주사기 플런저의 움직임으로 달성 주입 유체의 볼륨을 아니었 결정하는 다른 방법의 개발을 necessitated 사용됩니다. 우리는 인쇄와 바늘 샤프트의 측면에 부착된 수 졸업한 스케일을 개발했습니다. 사용되는 시스템에 따라, 그것은 유체 초승달 모양이 졸업식과 바늘 샤프트의 측면에 부착된 교정 카드를 정렬 수 있도록 microinjector의 바늘 홀더 넘어 바늘로부터 액체를 치환해야 할 수도 있습니다.
마지막으로,이 기법의 두 제약은 우리의 프로토콜에 설명되어 있습니다. 첫째, 두 사람은 일반적으로 가공 샘플의 수를 극대화하기 위해 주입 및 hemolymph 추출 단계를 모두 조정해야합니다. 둘째, 인슐린 내성 반응의 변화는 때로는 동일한 유전자형 이내에 관찰됩니다. 우리는이 개별 파리 한천에 얼음 고정 및 복구 아래있을 수 있습니다 변수 반응으로 인해 믿습니다. 신뢰할 수있는 결론이 그려되기 전에 그러므로, 샘플의 충분한 수를 검사해야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIA에서 YW.CF (AG21068, AG31086)에 보조금 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
