Summary
العثور على مسارات الحفظ إشارات الانسولين في ذبابة الفاكهة
Abstract
حفظ المواد الغذائية آليات الاستشعار الموجودة بين الثدييات وذبابة الفاكهة التي تشبه الببتيدات الانسولين والجلوكاجون الثدييات ، على التوالي وظيفة للحفاظ على توازن السكر في خلال مراحل النمو 1،2 اليرقات. وقد كشفت الدراسات عن الذباب الكبار إلى حد كبير بعد الإنقسامية من اضطراب توازن الجلوكوز نتيجة الاجتثاث الوراثية للأنسولين مثل الببتيد (ILP) الخلايا المنتجة (IPCS) 3. وهكذا ، ذباب الفاكهة الكبار على وعود كبيرة كنظام نموذج مناسب لالوراثية الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. لمزيد من تطوير نظام ذبابة الفاكهة ، يجب وضع المقايسات الفسيولوجية للمقارنة المستخدمة لقياس تحمل الغلوكوز والحساسية للانسولين في الثدييات. لهذا الغرض ، وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة إجراء الرواية الشفوية لقياس استجابة التسامح الجلوكوز في الطيران الكبار وأظهرت أهمية IPCS الكبار في الحفاظ على توازن السكر في 4،5. هنا ، قد عدلت أننا إجراء سبق وصفها للحقن الانسولين (6) ودمجتها مع طريقة استخراج الدملمف رواية لقياس حساسية الإنسولين الطرفية في الطيران الكبار. فريد ، لدينا بروتوكول يسمح القياسات الفسيولوجية المباشر على قدرة الطيران الكبار للتخلص من حمولة الجلوكوز الطرفية عند حقن الانسولين ، والمنهجية التي تجعل من الممكن لتوصيف المسوخ الانسولين مما يشير والتدخلات المحتملة التي تؤثر على تحمل الغلوكوز وحساسية الانسولين في الطيران الكبار.
Protocol
1. الحل تحضير الأنسولين
- تحضير الأنسولين البقري الطازج حل عن طريق إذابة الانسولين في برنامج تلفزيوني لتحقيق تركيز 0.01 ملغ / مل. يجب أن يبقى كل من الأنسولين / برنامج تلفزيوني وحلول التحكم في برنامج تلفزيوني على الجليد طوال إجراءات الحقن. وينبغي إعداد هذه الحلول مع 0.5 ٪ (V / V) FD & C لم الأزرق. 1 الغذاء التلوين.
2. تحضير وحقن ابرة تعيين المتابعة
- تعد الإبر الزجاج الشعرية باستخدام الإعدادات التالية puller.The micropipette مجتذب إنتاج الإبر ذات نوعية كافية للحقن : الحرارة ، 345 ؛ السحب ، 210 ؛ السرعة ، 100 ؛ من الزمن ، 200 (100ms). يجب اضعافها الإبر سحبت حديثا عن طريق الضغط على طرف من خلال نسيج Kimwipe. هذه العملية يزيل تصد ممدود غيض مقاومة عالية وتنتج تلميح stouter بقطر أكبر المسام.
- مكان الإبر اضعافها غيض المتابعة في أنبوب يحتوي على الأنسولين microcentrifuge / PBS حل أو برنامج تلفزيوني وحدها. عمل شعري النتائج في ملء الظهير كل إبرة. احتفال رأس الإبرة تحت stereomicroscope لضمان عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام تظهر على الحافة. تجاهل أي الإبر التي لا تملأ نظيفة.
- ادخال الإبر في شغل الإبرة حامل دليل microinjector وموقف حامل الإبرة مع micromanipulator بحيث طرف الإبرة مرئيا من خلال stereomicroscope. تطبيق الضغط الايجابي على عمود السائل في الإبرة التي تحول ميكرومتر microinjector مقبض يدوي تعلق على الغواص على حقنة microinjector.
- وقد تم تطبيق تحقق ما يكفي من الضغط لنزوح السوائل عن طريق لمس Kimwipe إلى رأس الإبرة وتؤكد تدفق السوائل.
- مرة واحدة وقد تم إعداد إبرة للحقن ، لصق مخطط المعايرة على جذع إبرة مع الشريط واضحة ، وجلب رأس الإبرة من خلال التركيز stereomicroscope 20X تحت التكبير.
3. يطير التحضير
- وتستخدم لمدة عشرة أيام عمره الذباب الإناث للتجارب الحقن. جمع الذباب في غضون 24 ساعة من eclosion. تخدير الذباب مع CO 2 مرطب على وسادة الغاز ، ويفرز الذكور والإناث في مكان الذباب قارورة تحتوي على معيار أو نظام غذائي العلاج. الحفاظ على وجبات الذباب الإناث تجريبية لمدة 10 يوما.
- في اليوم العاشر الموالي eclosion والانفصال إلى الوجبات التجريبية ، ونقل الذباب من المواد الغذائية التي تحتوي على قوارير على قارورة تحتوي على المكونات 5 مل من 2 ٪ ، وأغار عليها لتجويع 12-16 ساعة.
- نقل الذباب جوعا على قارورة تحتوي على مرشحات الجلوكوز 10 ٪ ينقع لمدة 1 ساعة قبل حقن الانسولين.
- تخدير لفترة وجيزة مع الذباب CO 2 مرطب بعد الرضاعة الجلوكوز ويستوقف ثم الباردة لهم على الجليد.
4. الحقن الداخلي
- فهم بلطف ذبابة يجمد الباردة مع زوج من ملقط الغرامة والاحتفاظ بها على مقربة من الحافة الإبرة بحيث غيض المتاخمة للمنطقة الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر الذبابة. جعل كل طرف الإبرة والصدر الذبابة في التركيز في إطار stereomicroscope.
- تحرك بلطف يطير باتجاه رأس الإبرة بحيث يلامس طرف إبرة وسط الناشزة في المنطقة اليسرى من الصدر prescutum الذبابة (الشكل 1). مرة واحدة موجه بشكل صحيح ويطير الانحياز مع طرف الإبرة ، ومواصلة التقدم في الطيران على الإبرة بحيث يخوزق إبرة وسط prescutum.
- تطبيق الضغط الايجابي حسب الحاجة من خلال دفع المكبس المحاقن مع مقبض micromanipulator في microinjector حتى تم ضخ 0.1 ميكرولتر من السوائل في الطيران. وتدفق السائل في hemocoel الذبابة إضفاء اللون الأزرق على الجانب الأيسر من الصدر الأمامي. أحيانا لا بد من التراجع والتقدم عدة مرات لإزاحة أي انسداد طرف إبرة والسماح لتدفق السوائل.
- السماح لاسترداد الذباب حقن في قارورة آغار 2 ٪ للحصول على نقاط قبل الوقت المحدد استخراج الدملمف.
5. الدملمف كوكتيل
- تخدير لفترة وجيزة مع الذباب ثاني مرطب 2 في الوقت المطلوب نقاط بعد الحقن ، وموقف كل جانب الظهرية يطير لأسفل على وجهين الشريط الملصقة على سطح اللوحة 2 CO. ترتيب الذباب في الصفوف حتى مع كبسولات رئيس الانحياز. يمكن للمرء استخدام عصا خشبية لقضيب قلص الصحافة اجنحتها في شريط لاصق ، وضمان عدم الحركة.
- مرة واحدة يتم إصلاح الذباب على الشريط ، واغتنام كل ذبابة خرطوم ملقط مع الغرامة وسحب برفق تجاه المنطقة البطنية ثم الخلفي للتحرك بحيث الجزء الأمامي من الرأس كبسولة وضوحا من خلال مجهر ستيريو.
- بيدك الأخرى ، وحين يمسك خرطوم في الموقف ، وثقب في وسط رأسه كبسولة فقط فوق الدرز ptilinal باستخدام إبرة حادة التنغستن (الشكل 2). يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم ادخال الإبرة بعيدا جدا لأنه من السهل لكمة غيض من الإبرة من خلال الجانب الآخر من كبسولة الرأس وتفقد في وقت لاحق جontrol تدفق الدملمف. ثقب الذباب كل ذلك في مجموعة الحقن قبل جمع الدملمف.
- بمجرد ثقب كبسولة الرأس ، واستخدام عصا خشبية قلص قضيب لتطبيق الضغط بلطف على بطن الذبابة. قد يكون من المفيد للفة تطير فوق ذلك أنه يعتمد على الجانب البطني وتطبيق الضغط. وسوف ينتج هذا الإجراء بقطرة من الدملمف من ثقب كبسولة موقع الرأس.
- لمسة واحدة من نهاية أنبوب microcapillary 1μl إلى قطرة الدملمف الناشئة من موقع رئيس ثقب كبسولة. سوف الدملمف أدخل أنبوب عبر العمل الشعري. تحديد وتسجيل كمية الدملمف جمعها عن طريق التحقق من عمود السائل داخل الأنبوب microcapillary ضد مخطط حجم تخرج.
6. الدملمف الجلوكوز تقدير
- إخراج عينات الدملمف microplate في الآبار التي تحتوي على 100 ميكرولتر من الجلوكوز الكاشف إنفينيتي. إبقاء لوحة على الجليد أثناء تحميل عينات الدملمف.
- إنشاء منحنى القياسية عن طريق تحميل كل على حدة 1 ميكرولتر من الحلول الأسهم الجلوكوز في 50mM ، 25mM ، 6.25mM ، و12.5mM 3.125mM.
- احتضان عينات في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية.
- كشف الامتصاصية في 340 نانومتر.
- لحساب حجم الدملمف جمع العينات وتحديد تركيز الغلوكوز استنادا إلى منحنى القياسية مع تركيز الجلوكوز معروفة.
7. ممثل النتائج
تم الكشف عن التسامح الانسولين استجابة نموذجية في الذباب ، حقن الانسولين حيث تم الكشف عن انخفاض مستويات السكر في تعميم 15 دقيقة بعد الحقن. في المقابل ، لا ينظر إلى مثل هذه الاستجابة في الذباب PBS حقن (الشكل 3). هذا الرد في التخلص من الغلوكوز المحيطي يستمر في حقن الانسولين الذباب ، يصل إلى 30 دقيقة بعد الحقن. نخرج بصورة روتينية 0،2-0،5 ميكرولتر من الدملمف 4-5 في الذباب في كل مجموعة الحقن. وشملت مجموعات ضخ ثلاثة في كل تجربة.
الشكل 1. الجانب الأيسر من الصدر ذبابة الفاكهة تظهر الإبرة موقع الإدراج (تم التعديل من Demerec ، 1950) 7. أدخل الإبرة من خلال مركز prescutum على المنطقة ، الظهرية الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر.
الشكل 2. عرض أمامي لرأس ذبابة الفاكهة تبين موقع البزل لاستخراج الدملمف (معدلة من Demerec ، 1950) 7. ثقب كبسولة الرأس مع التحقيق الذي تجريه التنغستن شحذ ناعما في وسط الكبسولة الرأس فقط فوق الدرز ptilinal.
الشكل 3. التسامح والانسولين استجابة نموذجية في الكشف عن سيطرة الكبار الذباب. تم حقن السيطرة الذباب ث 1118 مع الانسولين البقري (1 نانوغرام في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني فقط. ثم سمح الذباب في مجموعات لاسترداد نسخ دقائق 0 ، 15 أو 30 ومستويات السكر في تعميم تم قياسه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تقنية وصفها في هذا التقرير قد تكون مفيدة في أي دراسة العمليات الفيزيولوجية التي تحقق مما أدى إلى اكتشاف تغيرات في تركيبة الدملمف ذبابة الفاكهة. من خلال الجمع بين الحقن وجمع الدملمف بهذه الطريقة ، فمن الممكن للتأكد من الآثار المباشرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية للعلاج تجريبي معين أو التلاعب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية "سفك الدماء" في جمع أكثر من الدملمف التقنيات السابقة التي تنطوي على قطع الرأس 2 هو أن هذا الأسلوب يقلل من تلوث عينات الدملمف مع أخذ الأمعاء contents.If الحرص على عدم جمع أي pericerebral أنسجة الجسم من الدهون ، والتي قد تظهر أحيانا في ناضح الدملمف الحبرية ، ومن ثم ينبغي عينات تعكس بدقة حالة الدورة الدموية في سوائل الجسم الحي.
وثمة عامل يحتمل الخلط الكامنة في أي تجربة حقن أجريت في هذا النطاق هو التخفيف من السوائل الدموية الأولية التالية مجموع الحقن. ويمكن بسهولة أن يكون للرقابة لهذا ، ومع ذلك ، من خلال ضخ كميات من برنامج تلفزيوني في نفس الذباب التجريبية أو الأنسولين في العمر كعينة ضابطة وتطبيع النتائج. لضمان تعميم استنساخه قراءات الجلوكوز ، ونوعية قطرات الدملمف هو الأكثر أهمية. وينبغي جمع قطرات فقط واضح للالدملمف خالية من الدهون في الجسم أو غيرها من الحطام pericerebral الأنسجة لتحديد الجلوكوز. ومن الجدير بالذكر أيضا أنه ينبغي جمع ما يصل إلى 8 فقط عينات قبل تحديد تركيزات الجلوكوز النسبية. لاحظنا "الانجراف" في القراءات 340 OD عندما تركت عينات الدملمف على الجليد لفترة ممتدة من الزمن.
بروتوكول لدينا يترك مجالا كبيرا للتعديل على أساس المعدات المتوفرة. قد ضبط مجتذب الماصة تحتاج إلى تعديل استنادا إلى نموذج وحالة مجتذب. لقد وجدنا أن الأوضاع الملائمة لانتاج الخلايا الإبر القطب تسجيل مثالية لإبر الحقن. بالإضافة إلى ذلك ، بينما نحن توظيف micromanipulator ثلاثة محاور للحفاظ على موقف إبرة تحت المجسام ، يمكن أيضا أن يكون هذا يتحقق مع ringstand قوي ونظام الشبك والإبرة لا تزال في وضع ثابت طوال مدة إجراء الحقن. استخدمت مقاومة عالية من الإبر استلزم وضع طريقة بديلة لتحديد حجم السائل حقن حقنة كحركة المكبس 1:1 إلى حجم النزوح لم تكن قابلة للتحقيق. قمنا بتطوير مقياس متدرج يمكن أن تكون مطبوعة وتعلق على جانب من رمح الإبرة. اعتمادا على نظام المستخدمة ، قد يكون من الضروري لتهجير بعض السوائل من الإبرة وراء حامل الإبرة من microinjector بحيث يمكن محاذاة هلالة السوائل مع التخرج بطاقة المعايرة الملصقة على جانب من رمح الإبرة.
أخيرا ، لاحظت قيدين من هذه التقنية في بروتوكول لدينا. الأولى ، وعادة ما يطلب شخصين لتنسيق كل من الحقن والاستخراج الدملمف الخطوات من أجل زيادة عدد العينات المصنعة. الثانية ، ويلاحظ أحيانا اختلافات في استجابة الأنسولين التسامح داخل التركيب الوراثي نفسه. ونحن نعتقد أن هذا يرجع إلى ردود متغير الذباب الفردية قد التالية الشلل الجليد والاسترداد على أجار. ولذلك ، ينبغي النظر في عدد كاف من العينات قبل الاستنتاجات التي يمكن استخلاصها يمكن الاعتماد عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من جهاز الاستخبارات الوطنية لYW.CF (AG21068 ، AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
