Summary
איתות אינסולין נשמרת המסלולים נמצא זבוב הפירות
Abstract
שימור מנגנוני חישה התזונתיים הקיימים בין יונקים זבוב הפירות שבו פפטידים הדומה אינסולין גלוקגון יונקים, בהתאמה פונקציה לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז 1,2 במהלך שלבי התפתחות הזחל. מחקרים בעיקר שלאחר mitotic זבובים בוגרים חשפו ההפרעות של הומאוסטזיס הגלוקוז כתוצאה אבלציה הגנטי של פפטיד דמוי אינסולין (ILP) לייצר תאים (IPCs) 3. לפיכך, זבובי פירות בוגרים לקיים הבטחה גדולה כמערכת מודל מתאים גנטי הפרעות מטבוליות, כולל סוכרת מסוג II. על מנת להמשיך ולפתח את המערכת זבוב הפירות, מבחני השוואה פיזיולוגית למדידת סבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין אצל יונקים יש להקים. לשם כך, יש לנו תיאר לאחרונה הליך חדשנית למדידת גלוקוז העמסת תגובה לטוס מבוגרים הראו את החשיבות של IPCs מבוגרים בשמירה על הומאוסטזיס הגלוקוז 4,5. הנה, יש לנו נוהל שונה שתואר קודם להזרקת אינסולין 6 בשילוב עם שיטת השאיבה רומן hemolymph למדוד את הרגישות לאינסולין הפריפריה הזבוב הבוגר. באופן ייחודי, פרוטוקול שלנו מאפשרת מדידות פיזיולוגיות ישירה של היכולת לעוף של מבוגר להיפטר עומס הגלוקוז היקפית על הזרקת אינסולין, מתודולוגיה שעושה את זה אפשרי לאפיין מוטנטים אינסולין איתות התערבויות העשויים להשפיע על הסבילות לגלוקוז והרגישות לאינסולין הזבוב הבוגר.
Protocol
1. פתרון אינסולין הכנה
- הכן אינסולין טרי פתרון שור ידי המסת אינסולין PBS כדי להשיג את הריכוז של 0.01 מ"ג / מ"ל. שניהם אינסולין / PBS ושליטה פתרונות PBS חייב להישמר על הקרח לאורך הליך ההזרקה. פתרונות אלה צריכים להיות מוכנים עם 0.5% (V / V) FD & C Blue לא. 1 מזון צביעה.
2. מחט הכנה הזרקת הקמה
- הכן מחטים זכוכית נימי באמצעות puller.The micropipette הבאים הגדרות חולץ לייצר מחטים באיכות מספיק להזרקה: חום, 345; משוך, 210;, מהירות 100, זמן, 200 (100ms). מחטים משך טרי חייב להיות קהה על ידי לחיצה על קצה דרך רקמות Kimwipe. תהליך זה מסיר להקהות את חוד מוארך עמידות גבוהה ומייצרת טיפ יותר שמן עם נקבוביות בקוטר גדול יותר.
- מקום המחטים הקהה טיפ למעלה בצינור microcentrifuge המכיל את אינסולין / PBS פתרון או PBS לבד. נימי תוצאות הפעולה גב מילוי כל מחט. שים את קצה המחט תחת stereomicroscope, כדי לוודא ששום בועות אוויר פסולת או להופיע בקצה. מחק כל מחטים שלא למלא נקייה.
- הכנס מלא מחטים לתוך מחזיק microinjector ידני מחט עמדת בעל מחט עם micromanipulator כך חוד המחט גלוי דרך stereomicroscope. להפעיל לחץ חיובי על הטור נוזל המחט על ידי סיבוב ידית ידנית מיקרומטר microinjector המצורפת הבוכנה על המזרק microinjector.
- ודא כי הלחץ מספיק עקירה נוזל הוחל על ידי נגיעה Kimwipe אל קצה המחט, המאשר זרימת הנוזל.
- לאחר המחט הוכן הזרקה, להדביק תרשים כיול לפיר מחט עם סרט ברורה, ולהביא את קצה המחט אל המוקד באמצעות stereomicroscope בהגדלה 20X.
3. טוס הכנה
- עשרה ימים בת זבובים הנקבה משמשים לניסויים ההזרקה. איסוף זבובים בתוך 24 שעות של eclosion. הרדימי זבובים עם CO 2 humidified על כרית גז, למיין את הזכרים וזבובים המקום הנשי בתוך מבחנות המכילות סטנדרטי או דיאטה טיפול. שמור על זבובים הנשי על דיאטות ניסיונית למשך 10 ימים.
- ביום העשירי לאחר eclosion והפרדה על דיאטות ניסיוני, העברת זבובים צלוחיות מזון המכילים שלהם בקבוקונים המכילים תקע 5 מ"ל של אגר 2% ולהרעיב אותם במשך 12-16 ח
- העברת זבובים רעב בקבוקונים המכילים מסנני גלוקוז 10% ספוג שעה 1 לפני הזרקת אינסולין.
- בקצרה להרדים הזבובים עם 2 CO humidified לאחר האכלה גלוקוז ואז קר לשתק אותם על הקרח.
4. הזרקת נוהל
- בעדינות לתפוס זבוב קר משותק עם זוג מלקחיים בסדר להחזיק אותו קרוב קצה המחט, כך קצה צמוד באזור הקדמי של הצד השמאלי של בית החזה של הזבוב. תביאו גם את קצה המחט החזה של הזבוב אל המוקד תחת stereomicroscope.
- בעדינות להזיז את לעוף לכיוון קצה המחט כך חוד המחט נוגעת מרכז בליטה של האזור prescutum השמאלי של בית החזה של הזבוב (איור 1). לאחר לטוס מכוונת כראוי מיושר עם קצה המחט, להמשיך לקדם את זבוב על המחט כך המחט נועצת את מרכז prescutum.
- החל לחץ חיובי כנדרש על ידי קידום על הבוכנה מזרק עם ידית micromanipulator של microinjector עד 0.1 μl של נוזל כבר מוזרק לטוס. זרם של נוזל לתוך hemocoel של הזבוב יהיה להקנות צבע כחול בצד שמאל של בית החזה הקדמי. לעיתים יש לחזור ולקדם מספר פעמים כדי לסלק כל חסימה קצה מחט ולאפשר זרימת הנוזל.
- אפשר זבובים מוזרק להתאושש צלוחיות אגר 2% עבור נקודות זמן המיועד לפני מיצוי hemolymph.
5. Hemolymph אוסף
- בקצרה להרדים זבובים עם CO 2 humidified במוצב הזרקת נקודות הרצוי בזמן כל עמדה לטוס הגב בצד למטה על קלטת דו צדדית מודבקת על פני השטח של כרית CO 2. סדר זבובים אפילו שורות עם קפסולות ראש מיושר. אפשר להשתמש במקל המוליך עץ גזומים ללחוץ כנפיהם לתוך דבק קלטת להבטיח immobilization.
- לאחר זבובים קבועים לקלטת, לתפוס חוטם כל זבוב עם מלקחיים בסדר בעדינות למשוך אותו לכיוון האזור הגחוני ואז האחורי של הזבוב, כך הקדמי של הקפסולה בראש גלוי מבעד למיקרוסקופ סטריאו.
- עם היד השנייה ובזמן חוטם מחזיק בעמדה, לנקב את מרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal באמצעות מחט טונגסטן חדה (איור 2). יש להיזהר לא להכניס את המחט עמוק מדי כמו קל אגרוף קצה המחט דרך הצד השני של הקפסולה ראש ולאחר מכן לאבד גontrol של זרימת hemolymph. לנקב את כל הזבובים בקבוצה זריקה לפני איסוף hemolymph.
- לאחר הקפסולה הראש כבר ניקב, השתמש במקל המוליך עץ גזומים בעדינות כדי להפעיל לחץ על הבטן של הזבוב. זה עשוי להיות מועיל לגלגל את לטוס מעל כך שהוא נשען על הצד הגחוני שלה כפי שאתה להפעיל לחץ. הליך זה יהיה לייצר טיפה של hemolymph מאתר הקפסולה ראש לנקב.
- מגע קצה אחד של צינור microcapillary 1μl כדי אגל hemolymph המתעוררים מאתר הקפסולה ראש לנקב. Hemolymph ייכנסו לפעולה באמצעות צינור נימי. קבע ולהקליט את כמות hemolymph שנאספו על ידי בדיקת נוזל עמוד בתוך הצינור microcapillary נגד תרשים נפח בוגרת.
6. גלוקוז Hemolymph קביעת
- הוצאת דגימות hemolymph לתוך microplate בארות המכיל 100 μl של גלוקוז מגיב אינפיניטי. שמור על צלחת על הקרח בעת טעינת דגימות hemolymph.
- הקמת עקומת סטנדרט ידי טעינת בנפרד 1 μl כל המניות של פתרונות גלוקוז ב 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ו 3.125mM.
- דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- זיהוי ספיגת ב 340 ננומטר.
- חשבון עבור נפח hemolymph אסף לקבוע ריכוז הגלוקוז מדגם המבוססת על עקומת רגיל עם ריכוזי הגלוקוז ידוע.
7. נציג תוצאות
תגובה טיפוסית סבילות לאינסולין מזוהה האינסולין מוזרק זבובים היכן ירידה במחזור רמות הגלוקוז מזוהה 15 דקות לאחר ההזרקה. לעומת זאת, תגובה כזו לא ראיתי אצל זבובי PBS מוזרק (איור 3). זו התגובה סילוק הגלוקוז ההיקפי ממשיך להזריק אינסולין זבובים עד 30 דקות לאחר ההזרקה. אנו שגרתי לחלץ 0.2-0.5 μl של hemolymph לכל 4-5 זבובים בכל קבוצה ההזרקה. שלוש קבוצות הזרקת כלולים כל ניסוי.
באיור 1. בצד שמאל של בית החזה תסיסנית מראה הכניסה מחט באתר (השתנה מ Demerec, 1950) 7. הכנס את המחט דרך מרכז prescutum על האזור הקדמי של הגב בצד שמאל של החזה.
איור 2. התצוגה פרונטלי של ראש תסיסנית מראה מיקום לנקב להפקת hemolymph (השתנה מ Demerec, 1950) 7. לנקב את הקפסולה עם ראש בדיקה טונגסטן חידד דק במרכז הקפסולה הראש מעל תפר ptilinal.
איור 3. אינסולין טיפוסי סובלנות בתגובה זוהה מבוגר לשלוט זבובים. בקרת זבובים w 1118 הוזרקו אינסולין שור (1 ננוגרם ב PBS) או PBS בלבד. זבובים בקבוצות לשכפל הורשו אז להתאושש במשך דקות 0, 15 או 30 רמות הגלוקוז במחזור נמדדו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הטכניקה שתוארו בדו"ח זה הוא שימושי באופן פוטנציאלי בכל מחקר החוקר תהליכים פיזיולוגיים וכתוצאה מכך לגילוי שינויים בהרכב hemolymph תסיסנית. על ידי שילוב של הזרקה ואיסוף hemolymph באופן זה, ניתן לקבוע את ההשפעות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מיידית של טיפול ניסיוני מניפולציה מסוימת. היתרון העיקרי של הטכניקה הזו "הקזת דם" באוסף hemolymph לעומת טכניקות קודמות מעורבים 2 עריפת ראש היא כי טכניקה זו ממזערת הזיהום של דגימות hemolymph עם בטן טיפול contents.If נלקח לא לאסוף כל pericerebral רקמת השומן בגוף, אשר עשוי לעיתים מופיעים הקרין אגל hemolymph, אז דגימות צריך לשקף במדויק את מצב בנוזלי הדם vivo.
גורם בלבול פוטנציאלי הטמון בניסוי כל זריקה ביצע בקנה המידה הזה הוא דילול ראשוני של נוזלים הדם הכוללת הזרקת הבאים. זה יכול בקלות להיות נשלט על, לעומת זאת, על ידי הזרקת כמויות זהה של PBS אצל זבובי ניסיוני או אינסולין לעידן בהתאמה בקרות נרמול התוצאות. כדי להבטיח לשחזור קריאות גלוקוז במחזור, איכות טיפות hemolymph היא בעלת חשיבות מרבית. רק טיפות ברורה של hemolymph נטול שומן בגוף pericerebral פסולת או רקמות אחרות יש לאסוף לקביעת גלוקוז. זה גם ראוי לציין כי רק עד 8 דגימות צריך להיות שנאספו לפני קביעת ריכוזי הגלוקוז יחסית. שמנו לב "סחיפה" ב OD 340 קריאות כאשר דגימות hemolymph נותרו על הקרח במשך תקופה ארוכה של זמן.
פרוטוקול שלנו משאיר הרבה מקום שינוי מבוסס על ציוד זמין. חולץ הגדרות Pipet ייתכן שיהיה צורך לשנות מבוסס על מודל ועל מצבו של חולץ. מצאנו כי הגדרות נאותה לייצור תאיים אלקטרודה מחטים הקלטה הם אידיאליים עבור מחטי הזרקה. בנוסף, בעוד אנו עובדים micromanipulator שלוש ציר לשמירה מחט עמדה תחת stereoscope, זה יכול גם להיות מושגת עם ringstand חסון מערכת מהדק כמו מחט נשאר בתנוחה קבועה לאורך כל ההליך ההזרקה. עמידות גבוהה של מחטים בשימוש חייבה פיתוח של שיטה חלופית לקביעת נפח הנוזל מוזרק כתנועה מזרק הבוכנה 01:01 על עקירה נפח לא היה בר השגה. פיתחנו בהיקף בוגר שיכול להיות מודפס מצורף לצד פיר את המחט. בהתאם למערכת בשימוש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לתפוס קצת נוזל מן המחט מעבר מחזיק את המחט של microinjector כך המניסקוס נוזל יכול להיות מתואם עם סיום לימודים הכרטיס כיול מודבקת בדופן הפיר את המחט.
לבסוף, שתי המגבלות של טכניקה זו ציין בפרוטוקול שלנו. ראשית, שני אנשים נדרשים בדרך כלל כדי לתאם גם זריקה והוצאה hemolymph צעדים על מנת למקסם את מספר דגימות מעובד. שנית, וריאציות בתגובה סבילות לאינסולין הם נצפו לעתים בתוך גנוטיפ זהה. אנו מאמינים כי הדבר נובע התגובות משתנה זבובים בודדים אולי בעקבות immobilization קרח התאוששות על אגר. לכן, מספר מספיק של דגימות יש לבחון לפני המסקנות שניתן להסיק אמין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של NIA כדי YW.CF (AG21068, AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
