Summary
Signalisation de l'insuline conservées voies trouvés dans la mouche des fruits
Abstract
Conservé en nutriments des mécanismes de détection existent entre les mammifères et la mouche des fruits, où les peptides ressemblant d'insuline et de glucagon chez les mammifères, respectivement la fonction de maintenir l'homéostasie du glucose au cours du développement 1,2 stades larvaires. Les études sur les mouches adultes largement post-mitotiques ont révélé une perturbation de l'homéostasie du glucose comme le résultat d'ablation génétique de l'insuline-like peptide (PAI) de cellules productrices (IPC) 3. Ainsi, les mouches à fruits pour adultes sont très prometteurs en tant que système modèle génétique adapté à des troubles métaboliques, y compris le diabète de type II. Pour développer davantage le système de la mouche des fruits, des dosages physiologiques comparables utilisés pour mesurer la tolérance au glucose et la sensibilité à l'insuline chez les mammifères doivent être établis. À cette fin, nous avons récemment décrit une nouvelle procédure pour la mesure de la réponse orale de tolérance au glucose chez la mouche adulte et démontré l'importance d'IPC pour adultes dans le maintien de l'homéostasie du glucose 4,5. Ici, nous avons modifié la procédure décrite précédemment pour 6 injections d'insuline et l'a combiné avec une méthode d'extraction hémolymphe roman pour mesurer la sensibilité périphérique à l'insuline chez la mouche adulte. Unique, notre protocole permet des mesures physiologiques directs de la capacité de la mouche adulte est de disposer d'une charge en glucose périphériques après injection d'insuline, une méthodologie qui rend possible de caractériser les mutants signalisation de l'insuline et les interventions possibles concernant la tolérance au glucose et la sensibilité à l'insuline chez la mouche adulte.
Protocol
1. Préparation de la solution d'insuline
- Préparer une nouvelle solution insuline bovine en dissolvant l'insuline dans le PBS pour obtenir la concentration de 0,01 mg / ml. L'insuline / PBS et le contrôle des solutions PBS doit être conservé sur la glace pendant toute la procédure d'injection. Ces solutions doivent être préparées avec 0,5% (v / v) bleu FD & C non. 1 colorant alimentaire.
2. Préparation d'aiguille et l'injection Set-up
- Préparer des aiguilles de verre capillaire en utilisant une micropipette puller.The réglages suivants extracteur produire des aiguilles d'une qualité suffisante pour l'injection: la chaleur, 345; Pull, 210; vitesse, 100; Temps, 200 (100ms). Aiguilles fraîchement tiré doit être émoussé en appuyant sur la pointe grâce à un tissu Kimwipe. Ce processus supprime émousser la pointe allongée de résistance élevée et produit une pointe plus robuste avec un diamètre plus grand pore.
- Placez les aiguilles émoussées tip-up dans un microtube contenant de l'insuline / solution de PBS ou du PBS seul. Capillaire résultats de l'action en arrière-remplissage de chaque aiguille. Observez la pointe de l'aiguille sous un stéréomicroscope pour s'assurer qu'aucune bulle d'air des débris ou apparaître au bout. Jeter les aiguilles qui ne remplissent pas proprement.
- Insérer des aiguilles remplies dans le porte-aiguille microinjecteur manuel et la position du porte-aiguille avec un micromanipulateur sorte que l'aiguille est visible à travers une loupe binoculaire. Appliquer une pression positive sur la colonne de liquide dans l'aiguille en tournant le bouton du micromètre manuel microinjecteur attaché au piston de la seringue microinjecteur.
- Vérifiez que la pression suffisante pour le déplacement du liquide a été appliquée en touchant un Kimwipe à la pointe de l'aiguille et la confirmation de l'écoulement du fluide.
- Une fois que l'aiguille a été préparé pour l'injection, apposer un tableau d'étalonnage de la tige de l'aiguille avec du ruban adhésif clair, et amener la pointe de l'aiguille en lumière à travers une loupe binoculaire sous un grossissement de 20x.
3. Préparation Fly
- Dix jours d'âge mouches femelles sont utilisées pour des expériences d'injection. Recueillir des mouches dans les 24 h de l'éclosion. Anesthetize mouches avec du CO 2 humidifié sur un coussin de gaz, trier les mâles et les mouches femelles lieu dans des fioles contenant un étalon ou d'un régime de traitement. Maintenir mouches femelles sur les régimes expérimentaux pendant 10 jours.
- Sur le dixième jour suivant l'éclosion et la séparation sur les régimes alimentaires expérimentaux, le transfert des mouches de leurs produits alimentaires contenant des flacons dans des flacons contenant 5 ml d'une fiche d'agar 2% et les affamer pour les 12-16 h.
- Transfert des mouches affamées dans des flacons contenant des filtres de glucose à 10% à tremper pendant 1 heure avant l'injection d'insuline.
- Brièvement anesthésier les mouches avec du CO 2 humidifié après le repas du glucose puis d'immobiliser froide eux sur la glace.
4. Procédure d'injection
- Saisir délicatement la mouche à froid immobilisé avec une paire de pinces fines et maintenez-le à proximité de la pointe de l'aiguille pour que la pointe est adjacente à la région antérieure du côté gauche du thorax de la mouche. Réunir les deux bout de l'aiguille et le thorax de la mouche en lumière sous la loupe binoculaire.
- Déplacez doucement la volée vers la pointe de l'aiguille de sorte que l'aiguille touche le centre de la protubérance de la région du thorax prescutum laissé la mouche (Fig. 1). Une fois que la mouche est correctement orientés et alignés avec la pointe de l'aiguille, continuer à faire avancer la volée sur l'aiguille pour que l'aiguille empale le centre de la prescutum.
- Appliquer une pression positive, au besoin en faisant progresser le piston de la seringue avec le bouton micromanipulateur l'microinjecteur jusqu'au 0,1 l de liquide a été injecté dans la volée. L'écoulement de fluide dans les hemocoel la mouche va donner une couleur bleue sur le côté gauche du thorax antérieur. Parfois on doit se rétracter et l'avance à plusieurs reprises pour déloger toute obstruction pointe de l'aiguille et de permettre l'écoulement du fluide.
- Autoriser mouches injecté à récupérer dans des flacons de gélose à 2% pour les points de temps désigné avant l'extraction hémolymphe.
5. Collection hémolymphe
- Brièvement anesthésier les mouches avec du CO 2 à humidifié désiré points de temps après l'injection et la position de chaque mouche dorso-latéral vers le bas sur un ruban double face apposée sur la surface d'un CO 2 pad. Organiser des mouches, même dans les lignes avec des capsules tête alignée. On peut utiliser un bâton applicateur garni de bois pour faire pression sur leurs ailes dans le ruban adhésif et assurer l'immobilisation.
- Une fois que les mouches sont fixés à la bande, saisir proboscis chaque mouche avec une pince fine et tirez vers la région ventrale et postérieure de la mouche de telle sorte que l'avant de la capsule de la tête est visible à travers le microscope stéréo.
- Avec votre autre main et tout en maintenant la trompe en position, percer le centre de la capsule de la tête juste au-dessus de la suture ptilinal aide d'une aiguille de tungstène pointu (Fig. 2). Il faut être prudent à ne pas insérer l'aiguille trop loin car il est facile de frapper la pointe de l'aiguille à travers l'autre côté de la capsule céphalique et perdre contrôle des flux de l'hémolymphe. Crevaison mouches le tout dans un groupe d'injection avant de recueillir l'hémolymphe.
- Une fois la capsule céphalique a été perforé, utilisez un bâton applicateur garni de bois pour appliquer doucement la pression à l'abdomen de la mouche. Il peut être utile de rouler les survoler afin qu'il repose sur sa face ventrale que vous appliquez une pression. Cette procédure va produire une goutte d'hémolymphe du site de ponction tête de la capsule.
- Toucher une extrémité d'un tube de 1 microlitre microcapillaire à la goutte d'hémolymphe émergents du site de ponction tête de la capsule. L'hémolymphe va entrer dans le tube par capillarité. Déterminer et noter la quantité d'hémolymphe recueillies en cochant la colonne de fluide dans le tube microcapillaire contre un tableau de volume graduée.
6. Détermination du glucose hémolymphe
- Ejecter échantillons hémolymphe en microplaque contenant 100 ul de réactif glucose Infinity. Gardez la plaque sur la glace pendant le chargement des échantillons d'hémolymphe.
- Établir une courbe standard en chargeant séparément 1 pl chacune des solutions mères de glucose à 50 mM, 25mm, 12.5mm, 6.25mm et 3.125mM.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 10 minutes.
- Détecter l'absorbance à 340 nm.
- Compte pour le volume de l'hémolymphe recueillies et déterminer la concentration en glucose de l'échantillon basée sur la courbe standard avec des concentrations de glucose connue.
7. Les résultats représentatifs
Une réponse à l'insuline typiques de tolérance est détecté dans l'insuline injectée-mouches, où une baisse des taux circulants de glucose est détecté 15 minutes après l'injection. En revanche, une telle réponse n'est pas vu dans mouches PBS injecté (Fig. 3). Cette réponse de l'élimination du glucose périphériques continue de l'insuline injectée-mouches jusqu'à 30 minutes après l'injection. Nous faisons régulièrement l'extrait de 0,2 à 0,5 l de l'hémolymphe par 4-5 mouches dans chaque groupe d'injection. Trois groupes d'injection sont inclus dans chaque expérience.
Figure 1. Le côté gauche du thorax montrant la drosophile site d'insertion d'aiguille (modification du Demerec, 1950) 7. Insérez l'aiguille dans le centre de la prescutum sur la partie antérieure, région dorsale du côté gauche du thorax.
Figure 2. Vue frontale de la tête de la drosophile, montrant l'emplacement de ponction pour l'extraction de l'hémolymphe (modification du Demerec, 1950) 7. Piquer la capsule de la tête avec une sonde de tungstène finement aiguisé dans le centre de la capsule de la tête juste au-dessus de la suture ptilinal.
Figure 3. Une réponse à l'insuline typiques de tolérance détecté chez les adultes contre les mouches. Contrôle des mouches w 1118 ont été injectés avec de l'insuline bovine (1 ng dans PBS) ou PBS. Les mouches dans des groupes de reproduire ont ensuite été autorisés à récupérer pour les minutes 0, 15 ou 30 et les niveaux de glucose circulant ont été mesurés.
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Discussion
La technique décrite dans ce rapport est potentiellement utile dans toute étude qui examine les processus physiologiques entraînant des altérations décelables dans la composition de l'hémolymphe de drosophile. En combinant l'injection et la collecte de l'hémolymphe de cette manière, il est possible de déterminer les effets immédiats physiologiquement pertinents d'un traitement expérimental particulier ou de manipulation. Le principal avantage de cette «saignée» la technique dans la collecte de l'hémolymphe plus techniques précédentes impliquant la décapitation 2 est que cette technique minimise la contamination des échantillons avec des intestins hémolymphe soins contents.If est prise de ne pas collecter tout tissu du corps pericerebral graisse, ce qui peut parfois apparaître dans le exsudé gouttelettes hémolymphe, puis les échantillons doivent refléter fidèlement l'état de la circulation sanguine dans les fluides in vivo.
Un facteur de confusion potentiels inhérents à toute expérience d'injection réalisée à cette échelle est la dilution initiale des fluides circulatoires totale après l'injection. Cela peut facilement être contrôlé, cependant, en injectant le même volume de PBS dans les mouches expérimental ou de l'insuline dans l'âge des témoins appariés et en normalisant les résultats. Pour assurer reproductibles lectures de glucose circulant, la qualité des gouttelettes hémolymphe est de la plus haute importance. Seuls les gouttelettes claire de l'hémolymphe dépourvue de graisse du corps ou des débris pericerebral autres tissus doivent être collectés pour la détermination du glucose. Il est également intéressant de noter que seuls jusqu'à 8 échantillons doivent être prélevés avant de déterminer les concentrations de glucose relative. Nous avons remarqué une "dérive" de la DO 340 lectures lorsque les échantillons d'hémolymphe ont été laissés sur la glace pendant une période de temps prolongée.
Notre protocole laisse beaucoup de place pour la modification basée sur des équipements disponibles. Paramètres extracteur Pipet peut-être besoin d'être modifié sur le modèle et l'état de l'extracteur. Nous avons constaté que les réglages adéquats pour la production intracellulaire aiguilles électrode d'enregistrement sont idéales pour les aiguilles d'injection. De plus, tandis que nous avons employé un micromanipulateur à trois axes pour maintenir l'aiguille dans la position du stéréoscope, cela peut aussi être réalisé avec un ringstand robuste et système de pince que l'aiguille reste dans une position fixe pendant toute la procédure d'injection. La haute résistance des aiguilles utilisées nécessité le développement d'une méthode alternative pour déterminer le volume de fluide injecté en tant que mouvement de seringues 01h01 plongeur à déplacement de volume n'était pas réalisable. Nous avons développé une échelle graduée qui pourrait être imprimée et fixée sur le côté de la tige de l'aiguille. Selon le système utilisé, il peut être nécessaire de déplacer un peu de liquide de l'aiguille au-delà du porte-aiguille de l'microinjecteur sorte que le ménisque de liquide peuvent être alignés avec des graduations de la carte d'étalonnage apposés sur le côté de la tige de l'aiguille.
Enfin, deux limites de cette technique sont notés dans notre protocole. Tout d'abord, deux personnes sont généralement nécessaires pour coordonner l'injection et des étapes d'extraction hémolymphe afin de maximiser le nombre d'échantillons traités. Deuxièmement, les variations de réponse tolérance à l'insuline sont parfois observés au sein du même génotype. Nous croyons que cela est dû à des réponses variables mouches individu peut avoir après une immobilisation de la glace et la récupération sur gélose. Par conséquent, un nombre suffisant d'échantillons doivent être examinés avant que des conclusions fiables puissent être tirées.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la NIA à YW.CF (AG21068, AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
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- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
