Summary
ショウジョウバエに見られる保存されたインスリンのシグナル伝達経路
Abstract
保存された栄養感知のメカニズムが発達幼虫期の1,2時の血糖値の恒常性を維持するために、それぞれのペプチドは哺乳類のインスリンとグルカゴンに似た哺乳類やショウジョウバエ、機能間に存在する。主に有糸分裂後の成人のハエの研究は、インスリン様ペプチドの遺伝子除去（ILP）産生細胞（IPC）を3の結果としてグルコースの恒常性の摂動を明らかにした。したがって、成人ミバエは、II型糖尿病を含む代謝性疾患に適した遺伝的モデルシステムとして有望視されて保持する。さらにショウジョウバエのシステムを開発するには、哺乳動物における耐糖能とインスリン感受性を測定するために使用される同等の生理的アッセイを確立する必要があります。この目的のために、我々は最近、成人のハエにおける経口ブドウ糖負荷応答を測定するための新たな手順を記載していると4,5グルコース恒常性を維持するに成人IPCの重要性を示した。ここで、我々は、インスリンの注射6前述の手順を変更し、成体のハエで、末梢インスリン感受性を測定するために新たな血リンパの抽出法とそれを組み合わせている。一意に、我々のプロトコルは、インスリン注射、インスリンシグナル伝達変異体と大人のハエの耐糖能とインスリン感受性に影響を与える潜在的な介入を特徴づけることが可能になる方法論に応じて末梢グルコース負荷を処分する大人ハエの能力の直接的な生理学的な測定が可能です。
Protocol
1。インスリン溶液の調製
- は0.01 mg / mlの濃度を達成するためにPBSでインスリンを溶解することにより新鮮なウシのインスリン溶液を調製します。インスリン/ PBSおよび制御PBSの両方のソリューションは、注射の手順では氷上で保存する必要があります。これらのソリューションは、0.5％（v / v）のFD＆Cブルーなしで準備する必要があります。 1食品着色料。
2。針の準備とセットアップインジェクション
- マイクロピペットpuller.Theを使用してガラスキャピラリーの針を準備し、以下の引き手の設定は、注射のための十分な品質の針の生成：熱、345、プル、210、速度、100;時間、200（100ミリ秒）。たて針は、キムワイプの組織を通じて、先端を押すことによって平滑化されている必要があります。この鈍化過程では、細長い高抵抗チップを削除し、より大きな細孔径を持つstouterのヒントを生成します。
- 単独でインシュリン/ PBS溶液またはPBSを含むマイクロ遠心チューブにチップアッププレース鈍い針。各針のバック充填でアクションの結果をキャピラリー。ない破片や気泡が先端に表示されていないことを保証するために実体顕微鏡下で針の先端を観察。きれいに記入していない任意の針を捨てる。
- 針の先端が実体顕微鏡を通して見えるようにマイクロマニピュレータを手動マイクロインジェクターのニードルホルダーとの位置ニードルホルダーに充填して針を挿入します。微量注入器の注射器のプランジャーに接続されている手動マイクロインジェクターのマイクロメーターのノブを回して、針の流体列に正圧を適用します。
- その流体の変位のための十分な圧力が針の先端にキムワイプを触れると流体の流れを確認することで適用されていることを確認します。
- いったん針が明確なテープ付き注射、貼付ニードルシャフトにキャリブレーションチャートの準備、および20倍の倍率下実体顕微鏡を介して焦点に針の先端を持参されています。
3。準備を飛ぶ
- 10日齢の雌ハエは、注射の実験に使用されています。羽化後24時間以内にハエを集める。男性と場所雌ハエ標準出力または治療の食事療法を含むバイアルにガスのパッド上に加湿CO 2、ソートでハエを麻酔。 10日間実験飼料のメスのハエを維持する。
- 実験飼料の上で羽化し、分離後10日目に、転送が2％寒天5mlのプラグを含むバイアルに彼らの食糧を含むバイアルの便を運行する航空会社と12〜16時間にわたってそれらを飢えさせる
- インスリン注射前1時間、10％グルコース浸したフィルターを含むバイアルに飢えたハエを移す。
- 簡潔にグルコースの給餌後に加湿CO 2でハエを麻酔してから、冷たい氷の上に固定化する。
4。注射の手順
- 優しく細かいピンセットを持つコールド固定化フライをつかみ、先端はフライの胸部の左側の前方領域に隣接するようにそれは針の先端に近いホールド。実体顕微鏡下で焦点に針の先端とフライの胸部の両方をもたらす。
- 針の先端がフライの胸部（図1）の左前楯板領域の隆起の中心に触れるようにゆっくりと針の先端に向かって飛んで移動する。フライが適切な方向と針の先端で整列されると、針が前楯板の中心をimpalesように針の上にフライを進めていく。
- 流体の0.1μlのハエに注入されるまで、マイクロインジェクターのマイクロマニピュレータのノブとシリンジのプランジャーを進めることによって、必要に応じて正圧を適用します。ハエの血体腔への流体の流れは、前胸部の左側に青い色を与えるだろう。時折一つは、任意の針の先端の閉塞を取り除くと流体の流れを可能にするために数回を収納して進める必要があります。
- 注入されたハエは、血リンパの抽出の前に指定された時点で2％寒天バイアルに回復することができます。
5。血リンパコレクション
- 簡単に言うと、目的のポスト噴射の時点と位置で加湿CO 2でハエを麻酔背側を下にCO 2パッドの表面に貼付両面テープ上の各フライ。整列頭部カプセルと偶数行でハエを手配。一つは、テープの接着剤に羽を押すと固定化を確保するためにトリミングされた木製のアプリケータースティックを使用することができます。
- 頭部カプセルの前面にステレオ顕微鏡を通して見えるように一度ハエが、テープに固定細かい鉗子でそれぞれのハエの口吻を持ち、ゆっくりとフライの腹側と後、後部領域に向かってそれを引いている。
- もう一方の手を持つとの位置に口吻を保持しながら、穿刺だけでシャープなタングステン針（図2）を使用してptilinal縫合上記頭部カプセルの中心地。一つは、あまりにも遠く、それは頭部のカプセルの他の側面に針の先端をパンチするのは簡単ですし、続いてcを失うように針を挿入しないように注意する必要があります血リンパの流れのontrol。穿刺は全血リンパを収集する前に注射群で飛ぶ。
- 頭部カプセルが破裂されると、そっとその場の腹部に圧力を適用するためにトリミングされた木製のアプリケータースティックを使用してください。それはあなたが圧力を適用すると、その腹側に置いたようにフライをロールオーバーすると便利かもしれません。この手順では、頭部カプセル穿刺部位から血リンパの液滴が生成されます。
- 頭部カプセル穿刺部位から出てきた体液の液滴に1μlのマイクロキャピラリーチューブの一方の端をタッチしてください。血リンパは、毛細管現象を介してチューブを入力します。卒業ボリュームのチャートに対して、マイクロキャピラリーチューブ内の流体の列をチェックして収集した血リンパの量を決定し、記録します。
6。体液のグルコース定量
- インフィニティグルコース液100μlを含むマイクロプレートウェルに体液のサンプルを取り出します。血リンパのサンプルをロードしながら氷の上でプレートを保管してください。
- 50mmの25mmの、12.5mmの、6.25mMと3.125mMで別々に1μlのグルコースストック溶液のそれぞれをロードすることによって標準曲線を確立する。
- 37サンプルをインキュベート° Cで10分間。
- 340nmで吸光度を検出する。
- 血リンパのボリュームのアカウントが収集され、既知のグルコース濃度の標準曲線に基づいて、サンプルのグルコース濃度を決定する。
7。代表的な結果
典型的なインスリン耐性の応答はグルコースの循環レベルの低下は15分後の注射を検出されるインスリン注入ハエで検出される。対照的に、そのような応答は、PBSを注入ハエ（図3）には見られません。末梢グルコース処理のこの応答は30分後に注射するインスリン注入のハエで続行されます。我々は定期的に各注射群では4〜5ハエごとに血リンパの0.2から0.5μlを抽出する。三注入グループは各実験に含まれています。
図1針の挿入部位（Demerec、1950年から変更された） 中7件を表示ショウジョウバエの胸部の左側。胸部の左側の前部、背部上の前楯板の中心を通って針を挿入します。
図2血リンパの抽出のための穿刺の場所（Demerec、1950年から変更された） 中7件を表示ショウジョウバエの頭部の正面図。穿刺だけptilinal縫合上記頭部カプセルの中央に細かく削ったタングステンプローブを備えたヘッドカプセル。
図3：コントロールの成人で検出された典型的なインスリン負荷応答が飛ぶ。コントロールワット1118ハエは、ウシインスリン（PBS中の1 NG）またはPBSのみを注射した。複製グループのハエは、0、15または30分間回復させたと循環グルコースレベルを測定した。
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Discussion
このレポートに記載されている方法は、 ショウジョウバエの血リンパの組成の検出可能な変化をもたらす生理学的プロセスを調査するあらゆる研究に有用である可能性がある。この方法で注入し、血リンパのコレクションを組み合わせることで、それは特定の実験的治療または操作の直接の生理学的に関連する影響を把握することが可能です。断頭2を含む以前の技術よりも体液のコレクションでこの"流血"技術の主な利点は、腸contents.Ifケアが時々に現れる可能性のあるpericerebral脂肪体の組織を、収集しないように取られるとこの手法は、体液サンプルの汚染を最小限に抑えることです。血リンパの液滴を滲み、その後のサンプルは、正確に生体内循環液の状態を反映している必要があります。
このスケールで実行されたすべての注入実験に内在する潜在的交絡因子は、注射後の総循環流体の初期希釈です。これは、簡単に年齢をマッチさせたコントロールに実験的なハエやインスリンのPBSの同じ量を注入し、結果を正規化することによって、しかし、してコントロールすることができます。再現可能な循環グルコースの測定値を確保するために、体液滴の品質が最も重要である。 pericerebral脂肪体または他の組織の破片を欠いている体液の唯一の明確な液滴は、グルコース測定のために収集する必要があります。それは唯一最大8サンプルが相対的グルコース濃度を決定する前に収集する必要があることも注目に値する。我々は、血リンパのサンプルが長時間にわたって氷の上に残されたOD 340の測定値の"ずれ"に気づいた。
我々のプロトコルが利用できる機器に基づいて変更の余地を残します。ピペットプラーの設定は、プラーの機種や条件に基づいて変更する必要があります。我々は、細胞内記録電極の針を製造するための適切な設定が注射針に最適であることを見出した。さらに、我々はステレオスコープの下に針位置を維持するための3つの軸のマイクロマニピュレーターを用いながら、これはまた、頑丈なringstandで達成することができ、針が射出手順を通して固定位置に残っているシステムをクランプする。針の高抵抗は、ボリュームの変位に1:1のシリンジプランジャの動きとして注入された流体の体積を決定するための代替法の開発が必要使わ達成できませんでした。我々は、印刷とニードルシャフトの側面に取り付けることができる目盛りを開発。使用するシステムによっては、それは流体のメニスカスが針のシャフトの側面に貼り付けられた目盛りのキャリブレーションカードを使って整列されるように、針から微量注入器の針ホルダーを超えて、いくつかの流体を置換する必要があるかもしれません。
最後に、この手法の二つの制限は、我々のプロトコルに記載されています。最初、二人は通常、処理されたサンプルの数を最大にするために注入し、血リンパの抽出手順の両方を調整する必要があります。第二に、インスリン耐性の応答のばらつきは、時々同じ遺伝子型の中で観察される。我々は、これは個々のハエが寒天上に氷の固定化と回復に続く可能性がある変数の応答が原因であると考えています。信頼性の高い結論を導き出すことができる前に、したがって、十分な数のサンプルを調べる必要があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIAからYW.CF（AG21068、AG31086）への補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
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- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
