Summary
Konservierte Insulin-Signalwege in der Fruchtfliege gefunden
Abstract
Konservierte Nährstoff sensing Mechanismen existieren zwischen Säugetier und Fruchtfliege, wo Peptide ähnlich Säugetieren Insulin und Glukagon bzw. Funktion, um Glukose-Homöostase während der Entwicklung Larvenstadien 1,2 zu halten. Studien zu weitgehend post-mitotischen erwachsenen Fliegen haben Störung des Glukose-Homöostase als Ergebnis des genetischen Ablation von Insulin-like peptide (ILP) produzierenden Zellen (IPCs) 3 enthüllt. So halten erwachsenen Fruchtfliegen großes Versprechen als eine geeignete genetische Modellsystem für Stoffwechselstörungen wie Diabetes Typ II. Zur weiteren Entwicklung der Fruchtfliege System, müssen vergleichbare physiologische Tests verwendet werden, um die Glukosetoleranz und Insulinsensitivität bei Säugetieren messen eingerichtet werden. Zu diesem Zweck haben wir kürzlich ein neues Verfahren zur Messung der oralen Glukosetoleranztest Reaktion in die erwachsene Fliege beschrieben und demonstriert die Bedeutung der Erwachsenenbildung IPCs bei der Aufrechterhaltung Glukosehomöostase 4,5. Hier haben wir ein zuvor beschriebenes Verfahren zur Insulin-Injektion 6 modifiziert und kombiniert es mit einem neuartigen Hämolymphe-Extraktions-Verfahren der peripheren Insulinsensitivität in der erwachsenen Fliegen zu messen. Einzigartig ist, ermöglicht es unseren Protokoll direkte physiologische Messungen der Erwachsenen fliegen die Fähigkeit eines peripheren Glukose-Last auf Insulin-Injektion, eine Methodik, die es möglich, Insulin-Signalkaskade Mutanten und möglichen Interventionen beeinflussen Glukosetoleranz und Insulinsensitivität in die erwachsene Fliege zu charakterisieren, macht entsorgen.
Protocol
1. Insulin Herstellung der Lösung
- Bereiten Sie frische Rinder-Insulin durch Auflösen von Insulin in PBS, um die Konzentration von 0,01 mg / ml zu erreichen. Sowohl Insulin / PBS und Kontrolle PBS-Lösungen müssen auf dem Eis während der Injektion gehalten werden. Diese Lösungen sollten mit 0,5% (v / v) FD & C Blau nicht vorbereitet werden. 1 Nahrung Färbung.
2. Needle Vorbereitung und Injection Set-up
- Bereiten Kapillare Glasnadeln mit einer Mikropipette puller.The folgenden puller Einstellungen erzeugen Nadeln von ausreichender Qualität für die Injektion: Hitze, 345; Pull, 210; Velocity, 100; Zeit, 200 (100ms). Frisch gezapftes Nadeln müssen durch Drücken der Spitze durch eine Kimwipe Gewebe abgestumpft werden. Dieses Abstumpfen-Verfahren beseitigt die längliche hohe Spitze und erzeugt ein dicker Spitze mit einem größeren Porendurchmesser.
- Legen Sie abgestumpft Nadeln tip-up in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Insulin / PBS-Lösung oder PBS allein. Kapillarwirkung Ergebnisse in Back-Füllung jeder Nadel. Beachten Sie die Spitze der Nadel unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass keine Fremdkörper oder Luftbläschen an der Spitze erscheinen. Entsorgen Sie alle Nadeln, die nicht ganz gefüllt ist sauber.
- Legen gefüllt Nadeln in die manuelle Mikroinjektor Nadelhalter und die Position der Nadelhalter mit einem Mikromanipulator, so dass die Nadelspitze sichtbar durch ein Stereomikroskop. Bewerben positiven Druck auf die Flüssigkeitssäule in der Nadel durch Drehen des manuellen Mikroinjektor Mikrometer-Regler an den Kolben auf die Mikroinjektor Spritze.
- Überprüfen Sie, ob genügend Druck für Fluid-Verschiebung ist durch Berühren eines Kimwipe an der Spitze der Nadel und der Bestätigung Strömung angewendet worden.
- Sobald die Nadel für die Injektion vorbereitet, ein Messprotokoll anzubringen, um die Nadel Welle mit durchsichtigem Klebeband und bringen Sie die Nadelspitze in den Fokus durch ein Stereomikroskop unter 20-facher Vergrößerung.
3. Fly Vorbereitung
- Zehn Tage alte weibliche Fliegen sind für die Injektion Experimente verwendet. Sammeln Sie fliegt innerhalb von 24 h Schlüpfen. Anesthetize fliegt mit befeuchteten CO 2 auf einem Gas-Pad, aussortieren Männchen und stellen die weiblichen Fliegen in Fläschchen mit Standard-oder die Behandlung Ernährung. Behalten weibliche Fliegen auf experimentellen Diäten für 10 Tage.
- Am zehnten Tag nach Schlüpfen und die Trennung auf Versuchsdiäten, Fliegen übertragen aus ihrer Nahrung-haltige Fläschchen zu Fläschchen mit einem 5 ml-Stecker mit 2% Agar und verhungern sie für 12-16 h.
- Transfer verhungert fliegt Ampullen mit 10% Glucose getränkten Filter für 1 Stunde vor Insulininjektion.
- Kurz betäuben die Fliegen mit befeuchteten CO 2 nach der Glucose-Zufuhr und dann kalt immobilisieren sie auf Eis.
4. Injektionsverfahren
- Fassen Sie ein kalt-immobilisierten fliegen mit einer feinen Pinzette und halten Sie die Nadelspitze in der Nähe, so dass die Spitze befindet sich neben dem vorderen Bereich der linken Seite der Fliege Thorax. Bringen Sie beide die Nadelspitze und die Fliege Thorax in den Fokus unter dem Stereomikroskop.
- Bewegen Sie die fliegen in Richtung der Nadelspitze, so dass die Nadelspitze berührt das Zentrum der Höcker des linken prescutum Region der Fliege Thorax (Abb. 1). Nachdem die Fliege korrekt ausgerichtet ist und im Einklang mit der Nadelspitze, weiterhin die fliegen auf die Nadel so, dass die Nadel die Mitte des prescutum spießt Voraus.
- Bewerben positive Druck durch Vorschieben des Spritzenkolbens mit der Mikroinjektor der Mikromanipulator Knopf nötig, bis 0,1 ul der Flüssigkeit in-the-fly injiziert wurde. Die Strömung der Flüssigkeit in der Fliege hemocoel wird eine blaue Farbe auf die linke Seite des vorderen Thorax zu vermitteln. Gelegentlich muss man einfahren und vorab mehrmals, um alle Nadelspitze Blockade lösen und ermöglichen eine Strömung.
- Lassen Sie injizierten fliegt in 2% Agar Fläschchen für bestimmte Zeitpunkte vor Hämolymphe Extraktion erholen.
5. Hämolymphe Sammlung
- Kurz betäuben fliegt mit befeuchteten CO 2 in der gewünschten Nacheinspritzung Zeitpunkten und Position jedes fliegen dorsal-side-down auf doppelseitigem Klebeband angebracht, um die Oberfläche eines CO 2-Pad. Vereinbaren Sie fliegt in geraden Reihen mit Kopf Kapseln ausgerichtet. Man kann mit einem getrimmt Holzstab stick, ihre Flügel in die Band Kleber drücken und sicherstellen, Immobilisierung.
- Sobald Fliegen sind, um das Band fixiert, fassen jeweils Fliege Rüssel mit feinen Pinzetten und ziehen Sie es vorsichtig in Richtung der ventralen und dann hinteren Bereich der Fliege, so dass die Vorderseite des Kopfes Kapsel ist sichtbar durch die Stereo-Mikroskop.
- Mit der anderen Hand, und halten den Rüssel in Position, Punktion der Mitte des Kopfes Kapsel oberhalb der ptilinal Naht mit einem scharfen Wolfram-Nadel (Abb. 2). Man muss vorsichtig sein, die Kanüle nicht zu weit einfügen, wie es leicht ist, die Spitze der Nadel durch die andere Seite der Kopfkapsel Punsch und später verlieren controlle der Hämolymphe fließen. Punktion alle Fliegen in eine Spritze Gruppe vor dem Sammeln Hämolymphe.
- Sobald der Kopf Kapsel durchstochen hat, verwenden Sie eine abgespeckte Holzstab Stick drücken Sie leicht auf der Fliege Bauch. Es kann hilfreich sein, die Fliege um, so dass es beruht auf der Bauchseite, wie Sie Druck ausüben zu rollen. Dieses Verfahren wird ein Tröpfchen Hämolymphe aus der Kopfkapsel Einstichstelle zu produzieren.
- Berühren Sie ein Ende des 1μl Mikrokapillare Rohr auf die Hämolymphe Tropfen, die aus der Kopfkapsel Einstichstelle. Die Hämolymphe wird das Rohr durch Kapillarwirkung geben. Ermitteln und notieren Sie die Menge der Hämolymphe, indem Sie die Flüssigkeitssäule im Mikrokapillare Rohr gegen ein abgestuftes Volumen-Chart gesammelt.
6. Hämolymphe Glucose Bestimmung
- Eject Hämolymphe Proben in Mikrotiterplatten Vertiefungen mit 100 ul von Infinity Glucosereagenz. Halten Platte auf Eis beim Laden Hämolymphe Proben.
- Stellen Sie eine Standard-Kurve durch das Laden separat 1 ul jeder von Glukose Stammlösungen bei 50mm, 25mm, 12,5 mm, 6,25 mm und 3.125mM.
- Inkubieren Proben bei 37 ° C für 10 Minuten.
- Detect Absorption bei 340 nm.
- Konto für Hämolymphe Volumen gesammelt und bestimmen Probe Glucose-Konzentration auf die Standardkurve mit bekannten Glukosekonzentrationen basiert.
7. Repräsentative Ergebnisse
Ein typisches Insulintoleranz Antwort ist in der Insulin-Injektion fliegt, wo ein Rückgang der zirkulierenden Glukosespiegel 15 Minuten nach der Injektion erfasst wird. Im Gegensatz dazu ist eine solche Reaktion nicht in PBS injiziert Fliegen (Abb. 3). Diese Reaktion im peripheren Glukose zur Verfügung weiterhin in der Insulin-Injektion fliegt bis zu 30 Minuten nach der Injektion. Wir routinemäßig Extrakt 0,2-0,5 ul Hämolymphe pro 4-5 Fliegen in jeder Injektion Gruppe. Drei Injektion Gruppen sind in jedem Experiment einbezogen.
Abbildung 1. Linke Seite des Drosophila Thorax zeigt Nadel Insertionsstelle (Modified aus Demerec, 1950) 7. Legen Sie die Nadel durch die Mitte des prescutum auf der vorderen, hinteren Bereich der linken Seite des Thorax.
Abbildung 2. Frontansicht des Drosophila Kopf zeigt Punktionsstelle für Hämolymphe Extraktion (modifiziert nach Demerec, 1950) 7. Punktion der Kopfkapsel mit einer fein geschliffen Wolfram-Sonde in die Mitte des Kopfes Kapsel oberhalb der ptilinal Naht.
Abbildung 3. Ein typisches Insulintoleranz Reaktion unter Kontrolle Erwachsenen erkannt Fliegen. Control-w 1118 Fliegen wurden mit Rinder-Insulin (1 ng in PBS) oder PBS nur injiziert. Fliegen in replizieren Gruppen wurden dann für 0, 15 oder 30 Minuten und zirkulierenden Glukosespiegel wieder gemessen.
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Discussion
Die Technik in diesem Bericht beschrieben wird, potentiell nützlich in jeder Studie, die physiologischen Prozesse sich in nachweisbaren Veränderungen in Drosophila Hämolymphe Zusammensetzung untersucht. Durch die Kombination von Injektions-und Hämolymphe Sammlung auf diese Weise ist es möglich, die unmittelbare physiologisch relevanten Auswirkungen einer bestimmten experimentellen Behandlung oder Manipulation zu ermitteln. Der primäre Vorteil dieser "Aderlass"-Technik in Hämolymphe Sammlung im Vergleich zu früheren Verfahren, bei denen Enthauptung 2 ist, dass diese Technik Kontamination von Hämolymphe Proben minimiert mit gut contents.If wird darauf geachtet, keine pericerebral Fett Körpergewebe, die manchmal in die erscheinen sammeln strahlte Hämolymphe Tropfen, dann sollten Proben genau widerspiegeln den Zustand der in-vivo-Kreislauf-Flüssigkeiten.
Ein potenziell verwirrenden Faktor als Folge einer Injektion Experiment in dieser Größenordnung durchgeführt wird die erste Verdünnung von insgesamt Kreislauf Flüssigkeiten nach der Injektion. Dies kann leicht zu kontrolliert werden, aber nach Injektion des gleichen Volumina von PBS in experimentellen Fliegen oder Insulin in Alters-gematchten Kontrollen und Normalisierung Ergebnisse. Um sicherzustellen, reproduzierbare zirkulierenden Glukose Lesungen, ist die Qualität der Hämolymphe Tröpfchen von größter Bedeutung. Nur klare Tröpfchen Hämolymphe ohne pericerebral fetten Körper oder andere Gewebereste sollten für die Glukose-Bestimmung erfasst werden. Es ist auch bemerkenswert, dass nur bis zu 8 Proben vor der Bestimmung der relativen Glukosekonzentrationen gesammelt werden sollten. Wir haben festgestellt, eine "Drift" in OD 340 Lesungen bei der Hämolymphe Proben auf Eis wurden für einen längeren Zeitraum verlassen.
Unser Protokoll lässt viel Raum für Veränderung der verfügbaren Ausrüstung. Pipet Abzieher-Einstellungen müssen auf der Basis des Modells und der Zustand der Abzieher geändert werden. Wir haben festgestellt, dass die Einstellungen für die Herstellung von angemessenen intrazellulären Aufnahme Elektrodennadeln ideal für Injektionsnadeln sind. Darüber hinaus, während wir ein Drei-Achs-Mikromanipulator eingesetzt für die Aufrechterhaltung der Nadelposition unter dem Stereoskop, kann dies auch mit einem stabilen Ringstand und Spannsystem erreicht werden, wenn die Nadel bleibt in einer festen Position über das Injektionsverfahren. Die hohe Beständigkeit der verwendeten Nadeln die Entwicklung eines alternativen Verfahrens zur Bestimmung des Volumens der injizierten Flüssigkeit als 1:1 Spritzenkolben Bewegung, um die Lautstärke Verschiebung nicht zu erreichen war notwendig. Wir entwickelten eine Skala, die ausgedruckt und könnte an der Seite der Nadel Welle. Abhängig vom System verwendet wird, kann es notwendig sein, etwas Flüssigkeit aus der Nadel verdrängen jenseits der Nadelhalter des Mikroinjektor so dass die Flüssigkeit Meniskus mit Abstufungen ausgerichtet werden kann die Kalibrierung Karte angebracht, um die Seite der Nadel Welle.
Schließlich sind zwei Einschränkungen dieser Technik in unserem Protokoll vermerkt. Zuerst werden zwei Personen in der Regel erforderlich, um beide Einspritzung und Hämolymphe Extraktionsschritte zu koordinieren, um die Anzahl der Proben verarbeitet zu maximieren. Zweitens sind Variationen in Insulintoleranz Antwort manchmal innerhalb der gleichen Genotyp beobachtet. Wir glauben, dass dies durch variable Reaktionen einzelne Fliegen können folgende Eis Immobilisierung und Erholung auf Agar. Daher sollte eine ausreichende Anzahl von Proben untersucht werden, bevor verlässliche Schlussfolgerungen gezogen werden können.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIA zu YW.CF (AG21068, AG31086) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
