Summary
Sinalização da insulina conservada caminhos encontrados na mosca da fruta
Abstract
Conservado nutrientes mecanismos de detecção existem entre mamíferos e mosca das frutas, onde os peptídeos semelhante à insulina e glucagon mamíferos, respectivamente a função de manter a homeostase da glicose durante o desenvolvimento 1,2 estágios larval. Estudos sobre moscas em grande parte pós-mitóticas adultos revelaram perturbação da homeostase da glicose como o resultado da ablação genética de insulin-like peptide (ILP), produzindo células (IPCs) 3. Assim, as moscas de fruta adultos são uma grande promessa como um sistema modelo adequado genética para doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo II. Para aprofundar o sistema de mosca da fruta, comparável ensaios fisiológicos usados para medir a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina em mamíferos deve ser estabelecida. Para este fim, temos recentemente descrito um procedimento novo para medir a resposta de tolerância oral à glicose na mosca adulta e demonstraram a importância de IPCs adulto na manutenção da homeostase da glicose 4,5. Aqui, temos um procedimento modificado descrito anteriormente para a injeção de insulina 6 e isso combinado com um novo método de extração hemolinfa para medir a sensibilidade periférica à insulina na mosca adulta. Excepcionalmente, o nosso protocolo permite medições fisiológicas direta da capacidade da mosca adulta de dispor de uma carga de glicose periférica após a injeção de insulina, uma metodologia que viabiliza a caracterizar mutantes sinalizadora de insulina e intervenções potenciais que afetam a tolerância à glicose ea sensibilidade à insulina na mosca adulta.
Protocol
1. Preparação da solução de insulina
- Preparar a solução de insulina bovina fresca pela dissolução de insulina em PBS para atingir a concentração de 0,01 mg / ml. Tanto a insulina / PBS e soluções de controle PBS deve ser mantido no gelo durante todo o procedimento de injeção. Estas soluções devem ser preparadas com 0,5% (v / v) FD & C no Blue. Um corante alimentar.
2. Preparação da agulha e injeção de Set-up
- Prepare agulhas capilar de vidro usando uma micropipeta puller.The seguintes configurações extrator produzir agulhas de qualidade suficiente para injecção: Calor, 345; Pull, 210; velocidade, 100; Time, 200 (100ms). Agulhas acabada de tirar deve ser anulado pela pressionar a ponta através de um tecido Kimwipe. Este processo remove embotamento da ponta alongada de alta resistência e produz uma ponta stouter com um diâmetro maior dos poros.
- Lugar agulhas blunted ponta-up em um tubo de microcentrífuga contendo a insulina / PBS PBS solução ou sozinho. Capilar ação resulta em back-preenchimento de cada agulha. Observe a ponta da agulha sob um estereomicroscópio para garantir que nenhuma bolha de ar detritos ou aparecem na ponta. Descartar qualquer agulhas que não preencher de forma limpa.
- Inserir agulhas cheias no suporte manual da agulha microinjetor e posicione o suporte da agulha com um micromanipulador de modo que a ponta da agulha é visível através de um estereomicroscópio. Aplique uma pressão positiva sobre a coluna de fluido na agulha girando o botão micrômetro manual de microinjetor ligado ao êmbolo da seringa microinjetor.
- Verifique se pressão suficiente para o deslocamento de fluidos foi aplicada por tocar um Kimwipe para a ponta da agulha e confirmando o fluxo de fluido.
- Uma vez que a agulha foi preparado para injeção, apor um gráfico de calibração para o eixo da agulha com fita adesiva transparente, e trazer a ponta da agulha em foco através de um microscópio estereoscópico com 20X de ampliação.
3. Fly Preparação
- Dez dias de idade moscas fêmeas são usados para experimentos de injeção. Coletar moscas dentro de 24 h da eclosão. Anestesiar voa com CO 2 umidificado em uma almofada de gás, classificar para fora homens e moscas lugar feminino em frascos contendo dieta padrão ou tratamento. Manter as moscas fêmeas em dietas experimentais durante 10 dias.
- No décimo dia após a eclosão e separação para dietas experimentais, a transferência de moscas de seu alimento contendo frascos para frascos contendo um plugue de 5 ml de agar 2% e privá-los por 12-16 h.
- Transferência de moscas fome para frascos contendo filtros de glicose a 10% embebido por 1 hora antes da injeção de insulina.
- Brevemente anestesiar as moscas com CO 2 umidificado após a ingestão de glicose e, em seguida imobilizá-los frio no gelo.
4. Procedimento de injeção
- Gentilmente segure uma mosca frio imobilizado com uma pinça fina e segurá-la perto da ponta da agulha para que a dica é adjacente à região anterior do lado esquerdo do tórax da mosca. Trazer tanto a ponta da agulha e do tórax da mosca em foco sob o estereomicroscópio.
- Suavemente mova a voar em direção a ponta da agulha de modo que a ponta da agulha toca o centro da protuberância da região prescutum esquerdo do tórax da mosca (Fig. 1). Uma vez que a mosca é corretamente orientados e alinhados com a ponta da agulha, continuar a promover a voar para a agulha de modo que a agulha espeta o centro do prescutum.
- Aplicar pressão positiva, conforme necessário, avançando o êmbolo da seringa com o botão do micromanipulador microinjetor de até 0,1 mL de fluido foi injetado na mosca. O fluxo de fluido em hemocele da mosca dará uma cor azul para o lado esquerdo do tórax anterior. Ocasionalmente é preciso retirar e avançar várias vezes para retirar qualquer bloqueio ponta da agulha e permitir o fluxo de fluido.
- Permitir que voa injetado para recuperar em frascos de agar 2% para os pontos de tempo designados antes da extração hemolinfa.
5. Coleta de hemolinfa
- Brevemente anestesiar voa com CO 2 no umidificado desejado pontos após a injecção tempo e posição de cada lado da dorsal fly-down em fita dupla face afixada à superfície de um bloco de CO 2. Organizar voa no mesmo linhas com cápsulas cabeça alinhada. Pode-se usar uma vara de madeira recortada aplicador para pressionar as asas para a fita adesiva e garantir a imobilização.
- Uma vez que as moscas são fixos para a fita, segure proboscis cada mosca com uma pinça fina e puxe-o cuidadosamente para a região ventral e posterior da mosca de modo que a frente da cápsula cefálica é visível através do microscópio estéreo.
- Com a outra mão e, segurando a tromba na posição, fure o centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal usando uma agulha de tungstênio afiadas (Fig. 2). É preciso ter cuidado para não inserir a agulha muito longe, pois é fácil dar um soco na ponta da agulha através do outro lado da cápsula cefálica e, posteriormente, perder control do fluxo de hemolinfa. Punção todas as moscas em um grupo de injeção antes de coletar hemolinfa.
- Uma vez que a cápsula cefálica foi perfurado, use uma vara de madeira para aplicador aparadas aplique uma pressão suave abdômen da mosca. Pode ser útil para rolar a voar por cima de modo que repousa sobre o seu lado ventral como você aplicar pressão. Este procedimento irá produzir uma gota de hemolinfa a partir do sítio de punção cabeça cápsula.
- Toque em uma extremidade de um tubo 1μl microcapilar para a gota de hemolinfa emergindo do local da punção cabeça cápsula. A hemolinfa entra no tubo através de uma acção capilar. Determinar e registrar a quantidade de hemolinfa coletadas, verificando a coluna de fluido no interior do tubo microcapilar contra um gráfico de volume graduado.
6. Determinação de glicose hemolinfa
- Eject amostras hemolinfa em poços contendo 100 ul do Infinito Reagente glicose. Manter placa no gelo durante o carregamento de amostras de hemolinfa.
- Estabelecer uma curva padrão de carga separadamente cada 1 ml das soluções de reserva de glicose a 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM e 3.125mM.
- Incubar as amostras a 37 ° C por 10 minutos.
- Detectar absorvância a 340 nm.
- Conta do volume de hemolinfa coletadas e determinar a concentração de glicose da amostra com base na curva padrão com concentrações de glicose conhecido.
7. Resultados representante
Uma resposta típica de tolerância à insulina é detectado em insulina injetada moscas, onde uma queda nos níveis circulantes de glicose é detectado 15 minutos após a injecção. Em contraste, essa resposta não é visto em moscas PBS injetado (Fig. 3). Esta resposta na eliminação de glicose periférica continua em insulina injetada-moscas até 30 minutos após a injecção. Rotineiramente extrair 0,2-0,5 mL de hemolinfa por 4-5 moscas em cada grupo de injeção. Três grupos de injeção estão incluídos em cada experimento.
Figura 1. Lado esquerdo do tórax, mostrando Drosophila local da agulha de inserção (Modificado de Demerec, 1950) 7. Inserir a agulha através do centro da prescutum na região, anterior dorsal do lado esquerdo do tórax.
Figura 2. Vista frontal de Drosophila cabeça mostrando o local da punção por extração de hemolinfa (Modificado de Demerec, 1950) 7. Punção da cápsula cabeça com uma sonda de tungstênio finamente afiada no centro da cápsula cabeça logo acima da sutura ptilinal.
Figura 3. A resposta de tolerância à insulina típica detectada em adultos controle de moscas. Moscas controle w 1118 foram injetados com insulina bovina (1 ng em PBS) ou PBS apenas. Moscas em grupos replicar foram então autorizados a recuperar de 0, 15 ou 30 minutos e os níveis de glicose circulante foram medidos.
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Discussion
A técnica descrita neste relatório é potencialmente útil em qualquer estudo que investiga os processos fisiológicos, resultando em alterações detectáveis em Drosophila composição hemolinfa. Ao combinar a injeção e coleta de hemolinfa desta forma, é possível verificar os efeitos imediatos fisiologicamente relevantes de um determinado tratamento experimental ou manipulação. A principal vantagem desta "sangria" técnica na coleta de hemolinfa em relação às técnicas anteriores envolvendo decapitação 2 é que esta técnica minimiza a contaminação das amostras de hemolinfa com cuidado contents.If intestino é tomado para não recolher qualquer tecido do corpo pericerebral gordura, que às vezes pode aparecer na exuded gota hemolinfa, em seguida, as amostras devem refletir com precisão o estado do aparelho circulatório em fluidos vivo.
Um fator potencialmente de confusão inerente a qualquer experimento de injecção, realizado nessa escala é a diluição inicial de fluidos circulatória total após a injecção. Isto pode ser facilmente controlados, no entanto, injetando o mesmo volume de PBS em moscas experimental ou insulina em controles pareados por idade e normalizar os resultados. Para garantir reprodutíveis leituras de glicose em circulação, a qualidade de gotículas de hemolinfa é da maior importância. Apenas gotículas clara de hemolinfa desprovida de gordura corporal pericerebral ou restos de outros tecidos devem ser coletadas para a determinação de glicose. É também digno de nota que apenas até 8 amostras devem ser coletadas antes de determinar as concentrações de glicose relativa. Notamos uma "deriva" no OD 340 leituras quando as amostras de hemolinfa foram deixados no gelo por um período prolongado de tempo.
Nosso protocolo deixa muito espaço para modificação com base em equipamentos disponíveis. Configurações extrator pipeta pode precisar ser modificado com base no modelo e condição do extrator. Nós descobrimos que as configurações adequadas para a produção de agulhas eletrodo intracelular de gravação são ideais para as agulhas de injeção. Além disso, enquanto nós empregou um micromanipulador de três eixos para manter a posição da agulha sob o estereoscópio, isso também pode ser conseguido com um ringstand resistente e sistema de fixação que a agulha permanece em uma posição fixa durante todo o procedimento de injeção. A alta resistência das agulhas usadas exigiu o desenvolvimento de um método alternativo para determinar o volume de fluido injetado como um movimento 01:01 êmbolo da seringa para o deslocamento de volume não foi possível. Nós desenvolvemos uma escala graduada que pode ser impresso e anexado ao lado do eixo da agulha. Dependendo do sistema utilizado, pode ser necessário para substituir algum fluido da agulha além do suporte da agulha do microinjetor de modo que o menisco líquido pode ser alinhada com o cartão de formaturas de calibração afixada ao lado do eixo da agulha.
Finalmente, duas limitações desta técnica são notados em nosso protocolo. Primeiro, duas pessoas são geralmente necessários para coordenar a injeção e as etapas de extração de hemolinfa a fim de maximizar o número de amostras processadas. Em segundo lugar, as variações na resposta de tolerância à insulina são por vezes observadas no interior do mesmo genótipo. Acreditamos que este é devido a respostas variáveis moscas indivíduo pode ter seguintes imobilização de gelo e de recuperação em agar. Portanto, um número suficiente de amostras deve ser examinado antes de conclusões confiáveis podem ser tiradas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por concessões do NIA para YW.CF (AG21068, AG31086).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine insulin | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Infinity Glucose Reagent | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TR1541 | |
| Manual microinjector | Sutter Instrument Co. | ||
| P-87 Flamming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Single barrel borosilicate capillary glass | A-M Systems | 626000 | |
| FD&C Blue No. 1 | McCormick & Co. | ||
| 1 μl microcapillary tubes | Drummond Scientific | ||
| Three-axis manual micromanipulator and base | World Precision Instruments, Inc. |
References
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1118 (2002).
- Kim, S. K., Rulifson, E. J. Conserved mechanisms of glucose sensing and regulation by Drosophila corpora cardiaca cells. Nature. 431, 316-316 (2004).
- Broughton, S. J. Longer lifespan, altered metabolism, and stress resistance in Drosophila from ablation of cells making insulin-like ligands. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 3105-3105 (2005).
- Haselton, A. Partial ablation of adult Drosophila insulin-producing neurons modulates glucose homeostasis and extends life span without insulin resistance. Cell Cycle. 9, 3063-3063 (2010).
- Haselton, A. T., Fridell, Y. W. Adult Drosophila melanogaster as a model for the study of glucose homeostasis. Aging (Albany NY). 2, 523-523 (2010).
- Belgacem, Y. H., Martin, J. R. Disruption of insulin pathways alters trehalose level and abolishes sexual dimorphism in locomotor activity in Drosophila. J Neurobiol. 66, 19-19 (2006).
- Demerec, M. Biology of Drosophila. , John Wiley & Sons. New York. (1950).
