In vivo avbildning av Mouse Spinal Cord Använda Två-foton mikroskopi
Summary
En minimalinvasiv protokoll för att stabilisera musen ryggraden och utföra repetitiva<em> In vivo</em> Ryggmärgen avbildning med två-photon mikroskopi beskrivs. Metoden kombinerar en spinal stabilisering enhet och en anestesimetod att minimera luftvägarna som orsakas av rörelser och producera rå bilddata som inte kräver någon justering eller annan efterbearbetning.
Abstract
In vivo-avbildning med två-photon mikroskopi 1 i möss som är genetiskt modifierade att uttrycka fluorescerande proteiner i specifika celltyper 2-3 har betydligt breddat vår kunskap om fysiologiska och patologiska processer i många vävnader in vivo 4-7. I studier av det centrala nervsystemet (CNS), har det funnits en bred tillämpning av in vivo imaging i hjärnan, som har producerat en uppsjö av nya och ofta oväntade rön om beteendet av celler som nervceller, astrocyter, mikroglia, under fysiologiska eller patologiska tillstånd 8-17. Har dock mestadels tekniska komplikationer begränsat genomförandet av in vivo imaging i studier av levande mus ryggmärgen. Framför allt genererar de anatomiska närheten av ryggmärgen till lungorna och hjärtat betydande rörelse artefakt som gör bildbehandling levande ryggmärgen en utmanande uppgift. </p>
Vi utvecklade en ny metod som överbryggar de inneboende begränsningarna i ryggmärgen avbildning genom att stabilisera ryggraden, minska respiratorisk-inducerade rörelser och på så sätt underlätta användningen av två-photon mikroskopi för att bilden på musen ryggmärgen in vivo. Detta uppnås genom att kombinera en anpassad spinal stabilisering enhet med en metod för djup anestesi, vilket resulterar i en betydande minskning av andnings-inducerad rörelser. Denna video protokoll visar hur man utsätta ett litet område av den levande ryggmärgen som kan underhållas under stabila fysiologiska förhållanden under lång tid genom att hålla vävnadsskada och blödning till ett minimum. Representant råbilder förvärvade in vivo detalj i hög upplösning det nära förhållandet mellan mikroglia och kärlsystemet. En timelapse sekvens visar dynamiska beteende microglial processer i levande mus ryggmärgen. Dessutom en kontinuerlig genomsökning av samma z-ram visarär det enastående stabilitet som denna metod kan åstadkomma för att skapa högar av bilder och / eller filmer timelapse som inte kräver bildjustering efter förvärvet. Slutligen visar vi hur denna metod kan användas för att se över och Reimage samma område av ryggmärgen vid senare tidpunkter, vilket möjliggör longitudinella studier av pågående fysiologiska eller patologiska processer in vivo.
Protocol
Discussion
Den metod som beskrivs här tillåter stabila och repetitiva in vivo avbildning av tätbefolkade fluorescerande cellulära strukturer i ryggmärgen hos sövda möss med två-photon mikroskopi. Den stabila är ett resultat av en skräddarsydd spinal stabilisering enhet och en anestesimetod som minskar andningsfrekvensen-inducerad rörelse artefakt. Spinal stabilisering Enheten tillåter andrum under musen kroppen och kan byggas med kommersiellt tillgängliga spinal klämmor och huvudet montering bit (Fig. 1). Me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Multiple Sclerosis Society bevilja RG4595A1 / T för att DD och NIH / NINDS bidrag NS051470, NS052189 och NS066361 till KA Siffror och filmer anpassas och / eller omtryckt från Davalos et al., J Neurosci metoder. 2008 Mar 30, 169 (1) :1-7 Copyright 2008, med tillstånd från Elsevier.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1841 | 70 kDa, diluted in ACSF (3% w/v) |
| Ketamine HCl | Bionichepharma | NDC No: 67457-001-10 | Injectable, 50mg/ml |
| Anased | Lloyd Labs | NADA No: 139-236 | Xylazine injectable, 20mg/ml |
| Acepromazine | Vedco | NADA No: 117-531 | Injectable,10mg/ml |
| Artificial tears ointment |
Phoenix pharmaceutical |
NDC No: 57319-760- 25 |
Lubricant |
| Betadine | Fisher | 19-061617 | |
| McPherson-Westcott Scissors |
World Precision Instruments |
555500S | Curved, blunt-tip scissors |
| Straight Forceps | World Precision Instruments |
555047FT | Toothed tip forceps |
| Small vessel cauterize | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Gelfoam | Pharmacia,Pfizer Inc. | Mixer Mill MM400 | |
| Compact spinal cord clamps |
Narishige | STS-A | |
| Head holding adaptor | Narishige | MA-6N | |
| Gelseal | Amersham Biosciences Corp. |
80-6421-43 | |
| Lactated Ringers | Baxter Healthcare | 2B8609 | |
| Buprenex | Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc. |
NDC No: 12496- 6757-1 |
Buprenorphine, injectable |
| Baytril | Bayer | NADA 140-913 | Enrofloxacin, antibacterial injectable 2.27% (20ml) |
| Heating pad – Large | Fine Science Tools | 21060-10 |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat. Rev. Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 7, 449-463 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Davalos, D. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420, 812-816 (2002).
- Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons. Nature. 385, 161-165 (1997).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Wang, X. Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9, 816-823 (2006).
- Christie, R. H. Growth arrest of individual senile plaques in a model of Alzheimer’s disease observed by in vivo multiphoton microscopy. J. Neurosci. 21, 858-864 (2001).
- Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer’s disease. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1097, 40-50 (2007).
- Jung, S. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat. Med. 11, 572-577 (2005).
- Kim, J. V. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J. Immunol. Methods. 352, 89-100 (2010).
- Shakhar, G. Stable T cell-dendritic cell interactions precede the development of both tolerance and immunity in vivo. Nat. Immunol. 6, 707-714 (2005).
- Tadokoro, C. E. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T cells and dendritic cells in vivo. J Exp Med. 203, 505-511 (2006).
- Lindquist, R. L. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 5, 1243-1250 (2004).
- Schwickert, T. A. vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure. Nature. 446, 83-87 (2007).
