Immuno-Fluoreszenz-Assay von Leptospira-Surface-exponierten Proteine
Summary
Eine effiziente Methode, um Oberflächen-Exposition von Leptospira-Proteine zu beurteilen ist beschrieben. Die Methode ist speziell für die Störung des empfindlichen äußeren Membran von Leptospira-Zellen zu vermeiden. Diese Technik erfordert Beschäftigung von mehreren negativen Kontrollen, um die Integrität der äußeren Membran und eine Spezifität von Antikörper-Reaktion zu beurteilen.
Abstract
Bakterielle Oberflächenproteine in direktem Kontakt mit Wirtszellen und in Aufnahme von Nährstoffen aus der Umwelt 1 beteiligt. Aus diesem Grund können zelluläre Lokalisation Einblicke in die funktionelle Rolle der bakteriellen Proteine liefern. Oberflächen-Lokalisation von bakteriellen Proteinen ist ein wichtiger Schritt in Richtung Identifizierung von Virulenzfaktoren in Mechanismen der Pathogenität beteiligt.
Verfahren zur Fraktionierung von Leptospira-Membranen Mai 02 bis 05 werden selektiv für eine bestimmte Klasse von äußeren Membranproteinen (OMPs), wie Lipoproteine vs transmembrane OMPs und damit zu Fehlklassifikation führen. Dies dürfte sich aufgrund der strukturellen Unterschiede und wie sie sich an die äußere Membran verbunden. Lipoproteine sind mit Membranen über eine hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den N-terminale Lipid-Einheit (drei Fettsäuren) und der Lipid-Doppelschicht Phospholipide 6, 7 verbunden sind. Im Gegensatz dazu sind transmembrane OMPs typischerweise in die Lipid-Doppelschicht von amphipathischen β-Blätter in einem Fass-ähnliche Struktur 8, 9 angeordnet integriert. Darüber hinaus bedeutet Anwesenheit eines Proteins in der äußeren Membran nicht unbedingt gewährleistet, dass das Protein oder seine Domänen auf der Oberfläche ausgesetzt sind. Spirochäten äußeren Membranen sind dafür bekannt, fragil und erfordern daher Methoden, bei denen sanfte Manipulation von Zellen und die Einbeziehung von Sub-Surface-Protein kontrolliert, um die Integrität der äußeren Membran zu beurteilen.
Hier präsentieren wir ein Immunfluoreszenztest (IFA)-Methode, um direkt zu bewerten Oberfläche Exposition von Proteinen auf intakten Leptospiren. Diese Methode beruht auf der Anerkennung von Leptospira-Oberflächenproteine von Antigen-spezifischen Antikörpern. Hierbei werden Antikörper, die spezifisch für OmpL54 10 detetcted aftero Bindung an native, ausgesetzte Oberfläche Epitope. Vergleich der Antikörper-Reaktivität auf intakte gegenüber permeabilisierten Zellen ermöglicht die Evaluierung der zellulären Verteilung und ob ein Protein selektiv präsentieren auf Leptospira-Oberfläche ist. Die Integrität der äußeren Membran sollten anhand Antikörper gegen ein oder mehrere unterirdische Proteine, vorzugsweise im Periplasma lokalisiert werden.
Die Oberfläche IFA-Methode kann verwendet werden, um Oberflächen Exposition von Leptospira-Protein, an das spezifische Antikörper zur Verfügung zu analysieren. Sowohl die Nützlichkeit und die Einschränkung des Verfahrens hängt davon ab, ob die eingesetzten Antikörper sind in der Lage, auf native Epitope binden. Da Antikörper oft gegen rekombinante Proteine, Epitope des nativen, Oberflächen-exponierten Proteine ausgelöst werden, darf nicht angesetzt werden. Dennoch ist die Oberfläche IFA-Methode zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung Komponenten des intakten Bakterien Oberflächen. Diese Methode kann nicht nur für Leptospiren, aber auch andere Spirochäten und Gram-negativen Bakterien angewendet werden. Für eine stärkere Rückschlüsse auf Oberflächen-Exposition von OMPs, ist ein umfassender Ansatz mit mehreren Zell-Lokalisation Methoden 10 empfohlen.
Protocol
Discussion
Unsere Oberfläche IFA-Technik ist ähnlich, mit dem die Oberfläche Exposition verschiedener Borrelien 15, 16 und Leptospira 12, 17 Proteine zu demonstrieren. Die Details der Oberfläche IFA hier beschriebene Methode sollen die Manipulation von Zellen in dem Bemühen um äußere Membran Integrität zu erhalten minimieren und gleichzeitig die Vorteile der Tendenz der Leptospira Zellen auf Glas-Objektträger haften. Das Verfahren beinhaltet eine niedrigere Konzentration (2% versus 4%) Paraform…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom Public Health Service gewähren unterstützt AI-34431 (bis DAH) vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases und VA Medical Research Funds (bis DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
