Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Summary

Um

Abstract

Eritropoiese é um sistema modelo comumente usado para estudar a diferenciação celular. Durante a eritropoiese, pluripotentes humano adulto células-tronco hematopoéticas (HSCs) diferenciar em progenitores oligopotent, precursores e glóbulos vermelhos maduros ^1. Este processo é regulado por uma grande parte ao nível da expressão gênica, em que fatores de transcrição específicos ativar genes de linhagem específica, enquanto concomitantemente reprimindo genes que são específicos para outros tipos de células ^2. Estudos sobre fatores de transcrição que regulam a eritropoiese são frequentemente realizadas usando linhas de células humanas e camundongos, que representam, até certo ponto, as células eritróides, em determinadas fases de diferenciação ^3-5. Linhagens de células transformadas no entanto só pode imitar parcialmente células eritróides e mais importante é que eles não permitem que se compreensível estudar as mudanças dinâmicas que ocorrem como células progridem por muitos estágios para o seu destino eritróide final. Portanto, um desafio atual continua a ser o desenvolvimento de um protocolo para obter populações relativamente homogêneas de HSCs primária e células eritróides em vários estágios de diferenciação em quantidades que são suficientes para executar genômica e proteômica experimentos.

Aqui nós descrevemos um ex vivo protocolo de cultura de células para induzir a diferenciação eritróide de humano-tronco hematopoiéticas / progenitoras que foram isolados a partir de qualquer sangue do cordão umbilical, na medula óssea ou sangue periférico de adultos mobilizados com G-CSF (leucaférese). Este sistema de cultivo, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay ^6, usa citocinas e co-cultura em células mesenquimais para imitar o microambiente da medula óssea. Usando este protocolo diferenciação ex vivo, observamos uma ampliação forte de progenitores eritróides, uma indução de diferenciação exclusivamente para a linhagem eritróide e uma maturação completa para o estágio de enucleados células vermelhas do sangue. Assim, este sistema oferece uma oportunidade para estudar o mecanismo molecular de regulação da transcrição como células-tronco hematopoiéticas progresso ao longo da linhagem eritróide.

Estudando eritropoiese no nível de transcrição também requer a capacidade de sobre-expressar ou knockdown fatores específicos em células primárias eritróide. Para este fim, usamos um lentivírus mediada sistema de entrega de gene que permite a infecção eficiente de ambos dividindo e não dividir células ^7. Aqui nós mostramos que somos capazes de forma eficiente o knockdown TAL1 fator de transcrição em células primárias de eritróide humana. Além disso, a expressão GFP demonstra uma eficiência de infecção lentiviral cerca de 90%. Assim, o nosso protocolo prevê um sistema altamente útil para a caracterização da rede de regulação de fatores de transcrição que eritropoiese controle.

Discussion

Um certo número de métodos têm sido utilizados anteriormente para diferenciar células eritróides em cultura, com graus variáveis ​​de sucesso. Por exemplo, alguns protocolos, sem co-cultura em MS-5 permite a expansão de células eritróides, mas não são eficientes na produção de plena maturidade enucleados glóbulos vermelhos ^12-17. Enquanto outros métodos permitem enucleação eficiente, é à custa de proliferação ^18,19. O método que usamos aqui, inicialmente desenvolvido pelo laboratório Douay ^6, combina um passo inicial de cultura líquido, o que prolonga a amplificação de células durante os primeiros estágios de diferenciação eritróide e, portanto, nos proporciona um grande número de progenitores precoce (necessário para genômica e proteômica estudos) , e uma segunda etapa de co-cultura em MS-5 células mesenquimais, que é importante para maximizar a síntese de hemoglobina e para obter enucleação completa das células vermelhas do sangue. Duas limitações do nosso método são: 1) o grau ainda insuficiente de amplificação em estágios iniciais de diferenciação, que até agora impediu-nos a caracterizar plenamente os progenitores eritróides muito cedo no nível de proteína e 2) o alto custo de se realizar este protocolo, particularmente em uma grande escala.

A qualidade dos reagentes de cultura de células e citocinas é essencial para a diferenciação eritróide ex vivo. Notavelmente, a utilização do BIT (Tabela 2) como um substituto do soro é crítica. De fato em nossa experiência o uso de BIT eliminado lote para lote variações que experimentamos anteriormente (provavelmente devido a diferenças na pureza de reagentes) ao usar fontes separadas de soro bovino insulina, albumina e transferrina. Outro ponto crítico é a qualidade da camada de MS-5 usado para co-cultura de células eritróides. Na verdade, MS-5 células devem ser confluentes 70% quando as células eritróides são adicionados e deve ser trocada a cada 3-4 dias. Se o MS-5 células são muito confluentes, as células eritróides não vai crescer e diferenciar adequadamente. Além disso, insalubres MS-5 células tendem a se destacar, fazendo a colheita de células eritróides difícil.

Métodos anteriores usaram retrovírus para gene-entrega no tronco hematopoiéticas / progenitoras células em cultura. No entanto, os retrovírus infectam apenas células em divisão e portanto não são eficientes em infectar o repouso, principalmente células CD34 ⁺ isoladas do sangue do cordão umbilical, medula óssea ou leucaférese ^20. A principal vantagem das abordagens lentiviral para gene-entrega é que ele permite uma infecção eficiente das células, independentemente do seu estado de proliferação ^7,21. Nossa entrega gene lentiviral mediada permite uma forma eficiente knockdown ou sobre-expressar fatores de transcrição específicos que podem modificar o destino da célula. Apropriada análises fenotípicas (celular e molecular) pode ser concebido após a infecção para revelar fenótipos particular. Além disso, as condições de crescimento podem ser alterados para favorecer determinado tipos de células após a infecção. Ao longo destas linhas, neste protocolo que optaram por não usar qualquer método para selecionar as células infectadas pelo lentivírus por duas razões principais: 1) a nossa eficiência de infecção é muito alto (Figura 6C) e 2), estamos preocupados que os métodos utilizados para selecionar lentivírus células infectadas (por exemplo, células-ordenação ou antibiótico) são desviadas para os sobreviventes / proliferação de células que são capazes de expressar tanto o gene de resistência a antibióticos ou a marcador fluorescente em níveis elevados, assim, esconder um fenótipo potencial apoptótico.