<em> Исключая виво</em> Протокол для получения зрелых человеческих красных кровяных клеток из стволовых / прародителей описано. Кроме того, мы описываем эффективные лентивирусов-Метод доставки нокдаун TAL1 транскрипционных факторов в первичных эритроидных клеток. Эффективность лентивирус опосредованной доставки гена GFP продемонстрировать с помощью выражения вирусов.
Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage.
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.
Ряд методов были использованы ранее дифференцировать эритроидных клеток в культуре с переменным успехом. Например, некоторые протоколы без со-культуры на MS-5 позволяет расширение эритроидных клеток, но не эффективным в производстве полностью зрелых безъядерных эритроцитов 12-17. …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Л. Дуэ и МС Giarratana (Université Paris VI, Франция) за консультацией по бывшей естественных условиях дифференциации эритроидных, Д. Аллан и Х. Аткинс (Огржи, Канада) за предоставление образцов крови (полученные в Оттаве больницы по этике исследований Совет # 2007804-01H), Д. Trono (Ecole Polytechnique Federale Лозанны) для обеспечения лентивирусов векторов и FJ Дилворт (Огржи, Канада) для критически чтении рукописи. Этот проект был профинансирован CIHR гранта (СС-82813), чтобы MBCGP является получателем фонд Ontario вычислительный Обучение Regulomics Докторантура стипендий. МБ заведует кафедрой Канаде исследований в регуляции экспрессии генов.