Ein<em> Ex vivo</em> Protokoll zur Erzeugung reifen menschlichen roten Blutkörperchen aus hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir eine effiziente lentivirale-Delivery-Methode Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären erythroiden Zellen. Die Effizienz der Lentivirus vermittelten Gentransfer nachgewiesen wird, mit GFP-exprimierenden Viren.
Erythropoese ist eine häufig verwendete Modellsystem zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Während Erythropoese, pluripotenten adulten humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) in oligopotent Vorfahren, engagiert Vorläufern und reifen roten Blutkörperchen Zellen 1 zu unterscheiden. Dieser Prozess ist für einen großen Teil auf der Ebene der Genexpression, wobei spezifische Transkriptionsfaktoren aktivieren Linie-spezifischer Gene reguliert, während gleichzeitig unterdrücken Genen, die spezifisch für andere Zelltypen 2 sind. Studien über Transkriptionsfaktoren regulieren Erythropoese sind oft unter Verwendung von humanen und murinen Zelllinien, stellen zum Teil erythroiden Zellen zu bestimmten Stadien der Differenzierung 3-5. Allerdings transformierten Zelllinien nur teilweise imitieren erythroiden Zellen und vor allem sie nicht erlauben es, nachvollziehbar Studie der dynamischen Veränderungen, die als Zellen des Fortschritts ist möglich durch viele Stadien zu ihrer endgültigen erythroiden Schicksal. Somit bleibt eine aktuelle Herausforderung der Entwicklung eines Protokolls zu relativ homogenen Populationen von primären HSC und erythroiden Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu erhalten, die in Mengen, die ausreichen, Genomik und Proteomik Experimente durchzuführen sind.
Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Zellkultur-Protokoll zu erythroiden Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus entweder Nabelschnurblut, Knochenmark oder dem peripheren Blut Erwachsener mit G-CSF (Leukapherese) mobilisiert wurden, isoliert zu induzieren. Diese Kultur zeichnet sich anfänglich durch die Douay Labor 6 entwickelt, nutzt Zytokine und Co-Kultur auf mesenchymale Zellen in die Knochenmark-Mikroumgebung nachahmen. Mit dieser ex vivo Differenzierung Protokoll, beobachten wir eine starke Verstärkung von erythroiden Vorläuferzellen, eine Induktion der Differenzierung ausschließlich auf die erythroiden Linie und eine vollständige Reifung auf der Bühne des entkernten roten Blutkörperchen. So bietet dieses System die Möglichkeit, den molekularen Mechanismus der Regulation der Transkription als hämatopoetische Stammzellen Fortschritte auf dem erythroiden Linie zu studieren.
Studieren Erythropoese auf der Transkriptionsebene erfordert auch die Fähigkeit, über-express oder Knockdown spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Lentivirus-vermittelte Gentransfer-System, das für die effiziente Infektion von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 7 ermöglicht. Hier zeigen wir, dass wir in der Lage, effizient Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen sind. Darüber hinaus zeigt die GFP-Expression mit einem Wirkungsgrad von lentiviralen Infektion fast 90%. So bietet unser Protokoll ein sehr nützliches System für die Charakterisierung des regulatorischen Netzwerkes von Transkriptionsfaktoren, die Steuerung der Erythropoese.
Eine Reihe von Methoden wurden bereits zu erythroiden Zellen in Kultur zu differenzieren mit variabler Grad von Erfolg eingesetzt. Zum Beispiel können einige Protokolle ohne Co-Kultur auf MS-5 Ausbau der erythroiden Zellen sind aber nicht in der Herstellung von voll ausgereiften entkernte rote Blutkörperchen 12-17 effizient. Während bei anderen Methoden effizienter Enukleation ermöglichen, ist es auf Kosten der Verbreitung 18,19. Die Methode, die wir hier verwendet haben, zunächst von der Doua…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken L. Douay und MC Giarratana (Université Paris VI, Frankreich) für Beratung bei der ex vivo erythroiden Differenzierung, D. Allan und H. Atkins (Ohří, Kanada) für die Bereitstellung von Blutproben (erhalten unter der Ottawa Hospital Research Ethics Board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne) für die Bereitstellung der lentiviralen Vektoren und FJ Dilworth (Ohří, Kanada) für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von einem CIHR gewähren (MOP-82813), um MBCGP finanziert ist ein Empfänger einer Ontario Research Fund Computational Regulomics Ausbildung Postdoktoranden-Stipendium. MB hält den Canada Research Chair in der Regulation der Genexpression.