Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Summary

En

Abstract

Erytropoes är ett vanligt använt modellsystem för att studera celldifferentiering. Under erytropoes pluripotenta vuxen människa hematopoetiska stamceller (HSCs) differentiera till oligopotent progenitorceller, engagerade prekursorer och mogna röda blodkroppar ^1. Denna process regleras till stor del på nivån av genuttryck, där specifika transkriptionsfaktorer aktiverar härstamning-specifika gener medan samtidigt förtränga gener som är specifika för andra celltyper ^2. Studier av transkriptionsfaktorer som reglerar erytropoes utförs ofta med humana och murina cellinjer som representerar i viss mån, erytroida celler vid givna stadier av differentiering ^3-5. Men förvandlas cellinjer kan bara delvis härma erytroida celler och viktigast de inte tillåter en att begripligt studera de dynamiska förändringar som sker som celler framsteg genom många stadier mot deras slutgiltiga erytroida öde. Därför är fortfarande en aktuell utmaning att utveckla ett protokoll för att få relativt homogen befolkning av primär HSCs och erytroida celler i olika stadier av differentiering i tillräckligt stora mängder för att utföra genomik och proteomik experiment.

Här beskriver vi en ex vivo-protokoll cellodling att framkalla erytroida differentiering från mänskliga hematopoetisk stam / progenitorceller som har isolerats från antingen navelsträngsblod, benmärg eller vuxna perifert blod mobiliserade med G-CSF (leukaferes). Denna kultur-systemet, som ursprungligen utvecklats av Douay laboratoriet ^6, använder cytokiner och co-kultur på mesenkymala celler för att efterlikna mikromiljö benmärgen. Med denna ex protokoll vivo differentiering, observerar vi en stark förstärkning av erytroida progenitorceller, en induktion av differentiering uteslutande mot erytroida härstamning och en fullständig mognad till det stadium av enucleated röda blodkroppar. Således ger detta system en möjlighet att studera de molekylära mekanismen för transkriptionell reglering som hematopoetiska stamceller framsteg på erytroida härstamning.

Studera erytropoes på transkriptionell nivå kräver också förmåga att över-express eller ÖVERVÄLDIGANDE specifika faktorer i primär erytroida celler. För detta ändamål använder vi en lentivirus-medierad systemet gen leverans som möjliggör en effektiv infektion av både dela och icke-delande celler ^7. Här visar vi att vi kan effektivt ÖVERVÄLDIGANDE de TAL1 transkriptionsfaktor i primära mänskliga erytroida celler. Dessutom visar GFP uttryck en effektivitet Lentiviral infektion nästan 90%. Således ger vår protokollet ett mycket användbart system för karakterisering av den rättsliga nätverk av transkriptionsfaktorer som styr erytropoes.

Discussion

Ett antal metoder har tidigare använts för att skilja erytroida celler i kultur med varierande grader av framgång. Till exempel ger några protokoll utan co-kultur på MS-5 expansion av erytroida celler men är inte effektiva på att producera fullt mogna enucleated röda blodkroppar ^12-17. Medan andra metoder som medger effektivt enucleation är det på bekostnad av spridningen ^18,19. Den metod vi har använt här, från början utvecklats av Douay laboratoriet ^6, kombinerar ett första flytande kultur steg, vilket förlänger celler förstärkning under tidiga stadier av erytroida differentiering och därmed ger oss ett stort antal tidiga förfäder (som behövs för genomik och proteomik studier) och ett andra steg av samarbete kultur på MS-5 mesenkymala celler, vilket är viktigt för att maximera hemoglobin syntes och att få fullständig enucleation av röda blodkroppar. Två begränsningar av vår metod är 1) den fortfarande otillräcklig grad av förstärkning i de tidigaste stadierna av differentiering, som hittills har hindrat oss att till fullo karakterisera mycket tidigt erytroida stamfäder på proteinnivå och 2) den höga kostnaden för att utföra detta protokoll, särskilt i stor skala.

Kvaliteten på de reagenser cellkultur och cytokiner är viktigt för ex vivo erytroida differentiering. Framför allt är användningen av BIT (tabell 2) som ett serum ersättare kritisk. I själva verket enligt vår erfarenhet att använda BIT elimineras från sats till sats variationer som vi upplevt tidigare (troligen beroende på skillnader i reagensen renhet) när du använder olika källor av bovint serumalbumin, Insulin och transferrin. En annan kritisk punkt är kvaliteten på MS-5 lager som används för samarbetet kultur erytroida celler. I själva verket måste MS-5 celler vara 70% konfluenta när erytroida celler läggs till och måste bytas var 3-4 dagar. Om MS-5 celler är för konfluenta kommer erytroida celler växer inte och skilja ordentligt. Dessutom, ohälsosamma MS-5 celler tenderar att lösgöra, vilket gör att skörden av erytroida celler svårt.

Tidigare metoder har använts retrovirus för gen-leverans i hematopoetiska stamceller / stamceller i kultur. Men retrovirus infekterar bara dela celler och är därför inte effektiva i infekterar främst vilande CD34 ⁺ celler isolerade från navelsträngsblod, benmärg eller leukaferes ^20. Den största fördelen med Lentiviral metoder för gen-leverans är att det möjliggör en effektiv infektion av celler oberoende av deras spridning status ^7,21. Vår Lentiviral-medierad gen leverans gör att man effektivt ÖVERVÄLDIGANDE eller över-express faktorer transkription som kan ändra cellens öde. Lämpliga fenotypiska analyser (cellulära och molekylära) kan utformas efter infektion för att avslöja särskilt fenotyper. Dessutom kan tillväxten villkor ändras för att gynna viss cell-typer efter infektion. Längs dessa linjer, i detta protokoll har vi valt att inte använda någon metod för att välja lentivirus-infekterade celler av två skäl: 1) vår infektion effektivitet är mycket hög (Figur 6c) och 2) vi är oroliga för att de metoder som används för att välja lentivirus-infekterade celler (t.ex. cell-sortering eller antibiotika) är inställda överlevande / celler som förökar sig som har möjlighet att uttrycka antingen antibiotikaresistens genen eller fluorescerande markör på höga nivåer och därmed döljer en potentiell apoptotiska fenotyp.