<em> לשעבר vivo</em> פרוטוקול לייצר תאים אנושיים בוגרים הדם האדומים מתוך גזע / אבות hematopoietic מתואר. בנוסף אנו מתארים שיטה יעילה משלוח lentiviral ל מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי תאים erythroid. היעילות של משלוח גן בתיווך lentivirus מודגמת באמצעות וירוסים GFP להביע.
Erythropoiesis היא מערכת מודל נפוץ ללמוד התמיינות תאים. במהלך erythropoiesis, pluripotent אדם מבוגר hematopoietic בתאי גזע (HSCs) להתמיין אבות oligopotent, מבשרי מחויב ובוגרת כדוריות דם אדומות 1. תהליך זה מווסת על חלק גדול ברמה של ביטוי גנים, לפיו גורמי שעתוק ספציפיים להפעיל השושלת גנים ספציפיים במקביל תוך הדחקת גנים ספציפיים סוגי תאים אחרים 2. מחקרים על גורמי תעתוק ויסות erythropoiesis מבוצעות בדרך כלל באמצעות שורות תאים אנושיים המייצגות Murine, במידה מסוימת, תאים erythroid בשלבים נתון של בידול 3-5. שורות תאים יכולים להפוך זאת באופן חלקי בלבד לחקות תאים erythroid והכי חשוב הם לא מאפשרים אחד comprehensibly המחקר שינויים דינמיים המתרחשים התקדמות תאים בשלבים רבים לקראת גורלו הסופי erythroid שלהם. לכן, האתגר הנוכחי נותר פיתוח פרוטוקול להשיג אוכלוסיות הומוגניות יחסית של HSCs הראשי erythroid תאים בשלבים שונים של התמיינות בכמויות מספיקות כדי לבצע גנומיקה ניסויים proteomics.
כאן אנו מתארים vivo לשעבר לתא תרבות פרוטוקול להשרות התמיינות erythroid מן האדם גזע / ובתאים hematopoietic שהיו מבודדים מהדם או טבורי, מח עצם או דם היקפי מבוגר מגויסת עם G-CSF (leukapheresis). מערכת זו תרבות, שפותחה לראשונה על ידי המעבדה Douay 6, משתמשת ציטוקינים ושיתוף תרבות על תאים mesenchymal לחקות את microenvironment מח עצם. שימוש בפרוטוקול לשעבר בידול vivo, אנו צופים הגברה חזקה של אבות erythroid, אינדוקציה של דיפרנציאציה אך ורק כלפי השושלת erythroid ו התבגרות להשלים לשלב enucleated כדוריות דם אדומות. לכן, מערכת זו מספקת הזדמנות ללמוד את המנגנון המולקולרי של ויסות תעתיק התקדמות בתאי גזע hematopoietic לאורך השושלת erythroid.
לימוד erythropoiesis ברמה תעתיק גם דורש את היכולת גורמים ספציפיים מעל מפורשת או מציאה ב העיקרי תאים erythroid. לשם כך, אנו משתמשים lentivirus בתיווך משלוח גן מערכת המאפשרת זיהום יעיל של שניהם חלוקת ולא חלוקת תאים 7. כאן אנו מראים כי אנו מסוגלים ביעילות מציאה גורם שעתוק בתוך TAL1 העיקרי erythroid תאים אנושיים. בנוסף, ביטוי של GFP מדגים יעילות של זיהום lentiviral קרוב ל 90%. לפיכך, פרוטוקול שלנו מספק מערכת שימושית מאוד עבור אפיון של רשת רגולטורית של גורמי תעתוק כי erythropoiesis שליטה.
מספר שיטות שימשו בעבר להבדיל תאים erythroid בתרבות עם דרגות משתנות של הצלחה. לדוגמה, כמה פרוטוקולים ללא תרבות משותפת על MS-5 מאפשרת הרחבה של תאים erythroid אך אינם יעילים בהפקת לבגרות מלאה בתאי דם אדומים enucleated 12-17. בעוד שיטות אחרות לאפשר enucleation יעיל, זה על חשבונם של התפשטות …
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ל Douay ו MC Giarratana (אוניברסיטת פריס VI, צרפת) עצה על בידול vivo erythroid לשעבר, אלן ד 'וה' אטקינס (OHRI, קנדה) למתן דגימות דם (שהושג לפי מחקר החולים אוטווה אתיקה עמוד # 2007804-01H), ד Trono (אקול פוליטכניק הפדרלי דה לוזאן) עבור מתן וקטורים lentiviral ו FJ דילוורת' (OHRI, קנדה) עבור אנושות לקרוא את כתב היד. פרויקט זה מומן על ידי מענק CIHR (MOP-82813) כדי MBCGP הוא מקבל מלגת קרן מחקר אונטריו הדרכה Regulomics חישובית דוקטורים. MB הקתדרה למחקר בקנדה בתקנה של ביטוי גנים.