Summary
Bir
Abstract
Eritropoiesis hücre farklılaşması incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model sistem. Eritropoezi sırasında, pluripotent yetişkin insan hematopoietik kök hücreleri (HKH'lerin) oligopotent progenitörlerle taahhüt öncüleri ve olgun kırmızı kan hücreleri 1 farklılaşırlar. Bu süreç, eş zamanlı olarak, diğer hücre türleri 2 için belirli genlerin bastırma soy belirli genlerin spesifik transkripsiyon faktörleri aktive sayede gen ekspresyonu, düzeyinde büyük bir kısmı için düzenlenir. Eritropoez düzenleyen transkripsiyon faktörleri ile ilgili çalışmalar genellikle farklılaşma 3-5 aşamada, bir dereceye kadar, eritroid hücreler temsil insan ve fare hücre hatları kullanılarak yapılmaktadır. Ancak dönüştürülmüş hücre hatları eritroid hücreler sadece kısmen taklit edebilir ve en önemlisi de bir anlaşılır son eritroid kaderi karşı birçok aşamalardan geçerek hücreler ilerleme olarak ortaya çıkan dinamik değişiklikleri incelemek için izin vermez. Bu nedenle, güncel bir sorun genomik ve proteomik deneyler gerçekleştirmek için yeterli miktarda farklılaşma çeşitli aşamalarında birincil HKH'lerin ve eritroid hücrelerin nispeten homojen nüfus elde etmek için bir protokol gelişme kalır.
Burada, kordon kanı, kemik iliği, veya G-CSF (leukapheresis) ile mobilize yetişkin periferik kan ya da izole edilmiştir insan hematopoietik kök / progenitör hücrelerin eritroid farklılaşma ikna etmek için bir ex vivo hücre kültürü protokolü açıklar . Başlangıçta Douay Laboratuvar 6 tarafından geliştirilen bu kültür sistemi, kemik iliği mikroçevresinin taklit etmek, mezenkimal hücreler sitokinler ve co-kültür kullanır . Bu ex vivo farklılaşması protokolü kullanarak, güçlü bir amplifikasyon eritroid progenitörlerle özel eritroid soy ve enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin sahne için tam bir olgunlaşma yolunda farklılaşma bir indüksiyon gözlemliyoruz. Böylece, bu sistem eritroid soy boyunca hematopoietik kök hücre ilerleme olarak transkripsiyonel yönetmelik moleküler mekanizmayı incelemek için bir fırsat sağlar.
Transkripsiyonel düzeyde eritropoezi incelenmesi aynı zamanda birincil eritroid hücrelerde aşırı açık veya demonte özgü faktörler yeteneği gerektirir. Bu amaçla, bölme ve bölünen hücreleri 7 hem de verimli bir enfeksiyon için izin veren bir lentivirüs-aracılı gen dağıtım sistemi kullanır . Burada biz verimli birincil insan eritroid hücrelerde transkripsiyon faktörü TAL1 demonte mümkün olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, GFP ifade lentiviral enfeksiyon% 90 yakın bir verimlilik göstermektedir. Böylece, protokolü düzenleyici transkripsiyon faktörleri ağ kontrol eritropoezi karakterizasyonu için oldukça yararlı bir sistem sağlar.
Discussion
Yöntemler bir dizi değişken derecelerde başarı ile kültür eritroid hücrelerin ayırt etmek için daha önce kullanılmıştır. Örneğin, MS-5 ko-kültür olmadan bazı protokolleri eritroid hücrelerin genişlemesi sağlar, ancak 12-17 tam olgun enükleasyon kırmızı kan hücrelerinin üretiminde etkili değildir . Diğer yöntemlerle verimli enükleasyon izin verirken, proliferasyon 18,19 pahasına. Başlangıçta Douay laboratuvar 6 tarafından geliştirilen, burada kullanılan yöntem, (genomik ve proteomik çalışmaları için gerekli), eritroid farklılaşmanın erken aşamalarında hücre amplifikasyon uzatır ve böylece çok sayıda erken atalarıdır bize sağlayan bir başlangıç sıvı kültür adım birleştirir ve ko-kültür, hemoglobin sentezi en üst düzeye çıkarmak için ve kırmızı kan hücrelerinin tam enükleasyon elde etmek için önemli olan MS-5 mezenkimal hücreler, ikinci bir adım. İki yöntemin sınırlamalar, şimdiye kadar tam protein düzeyi ve 2) bu protokolü yerine yüksek maliyetli çok erken eritroid atalarıdır karakterize bizi engellemiştir amplifikasyon farklılaşma ilk aşamada 1) hala yetersizdir derece, özellikle büyük ölçekli.
Hücre kültürü reaktifler ve sitokinlerin kalitesi, ex vivo eritroid farklılaşması için esastır . Özellikle, serum yerine BIT kullanımı (Tablo 2) kritik önem taşımaktadır. Gerçekten de deneyimlerimiz BIT kullanımı Sığır serum albümin, İnsülin ve Transferrin ayrı kaynakları kullanarak (muhtemelen reaktif saflık farklılıklar nedeniyle) daha önce yaşamış toplu toplu varyasyonlar yok. Bir başka kritik nokta eritroid hücrelerin ortak kültürü için kullanılan MS-5 kat kaliteli. Eritroid hücreler eklenir ve her 3-4 günde bir değiştirilmesi gerekir Gerçekten de, MS-5 hücreler% 70 konfluent gerekir. MS-5 hücreleri çok konfluent iseniz, eritroid hücrelerin büyümesi ve düzgün bir şekilde ayırt. Buna ek olarak, sağlıksız MS-5 hücreleri ayırmak için, eritroid hücrelerin hasat zor eğilimindedir.
Önceki yöntemleri kültür hematopoietik kök / progenitör hücreleri gen teslim retrovirüs kullandık. Ancak, retrovirüsler sadece bölünen hücreleri enfekte ve bu nedenle, kordon kanı, kemik iliği ya da leukapheresis 20 izole özellikle latent CD34 + hücrelerin enfekte verimli değildir. Gen-teslimi için lentiviral yaklaşımların ana avantajı, kendi çoğalması durumu 7,21 bağımsız hücrelerin etkin bir enfeksiyon izin vermesidir . Bizim lentiviral-aracılı gen teslim sağlar verimli bir şekilde demonte hücre kaderini değiştirebilir ya da aşırı-express özel transkripsiyon faktörleri. Uygun fenotipik analizler (hücresel ve moleküler) enfeksiyonu sonrası özellikle fenotipleri ortaya çıkarmak için tasarlanabilir. Buna ek olarak, büyüme koşulları, özellikle enfeksiyon sonrası hücre tipleri lehine değişmiş olabilir. Bizim enfeksiyon verimliliği çok yüksek 1) (Şekil 6C) ve 2) yöntemleri seçmek için kullanılır endişe: Bu doğrultuda, bu protokol iki ana nedenden dolayı lentivirüs enfekte olan hücreleri seçmek için herhangi bir yöntem kullanmak için seçtik lentivirüs enfekte olan hücreleri (örneğin hücre sıralama veya antibiyotik), ya, böylece olası bir apoptotik fenotip gizlemek yüksek seviyelerde antibiyotik direnç geni ya da floresan işaretleyici ifade edebilmek hücreleri hayatta / prolifere karşı önyargılı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz kan örnekleri (Ottowa Hastanesi Araştırma Etik Kurulu altında elde edilen sağlamak için ex vivo eritroid farklılaşma, D. Allan ve H. Atkins (Ohri, Kanada) tavsiye L. Douay ve MC Giarratana (Université Paris VI, Fransa) teşekkür # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) eleştirel bir yazının okunması için lentiviral vektörler ve FJ Dilworth (Ohri, Kanada) sağlamak için. Bu proje MBCGP bir CIHR hibe (MOP-82.813) tarafından finanse edildi Ontario Araştırma Fonu Hesaplamalı Regulomics Eğitim Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı. MB, Kanada Araştırma Başkanı Gen İfadesi Yönetmeliği tutar.
References
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
- Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
- Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
- Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
- Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
- Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
- Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
- Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
- Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
- Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
- Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
- Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
- Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
- Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
- Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
- Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
- Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).
