يتم تحضين العوالق البكتيرية البيئية مع نموذج حل الكربون العضوي (DOC) المركب ووضع العلامات كاشف الحمض النووي ، bromodeoxyuridine (BrdU). بعد ذلك ، يتم فصل الخلايا DOC – المهينة الجزء الأكبر من المجتمع على أساس إدماجها BrdU مرتفعة باستخدام الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS). ثم يتم تحديد هذه الخلايا الجزيئية تحليلات لاحقة.
الميكروبات وكلاء كبرى تتوسط في تدهور العديد من الكربون العضوي المذاب (DOC) ركائز في البيئات المائية. ومع ذلك ، وتحديد الأنواع البكتيرية التي تحول تجمعات محددة من DOC في الطبيعة يشكل تحديا تقنيا.
نحن هنا وصف نهج الأزواج bromodeoxyuridine (BrdU) التأسيس ومضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) ، و16S الرنا الريباسي الجينات الجزيئية التحليل القائم على الثقافة التي تسمح بتحديد مستقلة قادرة على العوالق البكتيرية المهينة مجمع DOC محددة في البيئات المائية. يتم تعيين عوالم مصغرة العوالق البكتيرية ثلاث نسخ لتلقي كل من BrdU ومجمع DOC طراز (DOC التعديلات) ، أو BrdU فقط (عدم التحكم بالإضافة إلى ذلك). بدائل يمكن BrdU مواقف ثيميدين في الحمض النووي البكتيري توليفها BrdU حديثا والتي تحمل علامات الحمض النووي يمكن 1،2 immunodetected بسهولة. العوالق البكتيرية من خلال 24 ساعة ، حضانة التي تكون قادرة على استخدام ويتوقع المجمع DOC أضاف تفعيلها بشكل انتقائي ، وبالتالي ارتفاع مستويات التأسيس BrdU (خلايا مرحبا) من غير استجابة الخلايا في التعديلات DOC والخلايا في عدم بالإضافة إلى ذلك الضوابط (انخفاض خلايا BrdU التأسيس ، وخلايا LI). بعد مضان مناعي ، وتتميز الخلايا مرحبا وفصلها ماديا من الخلايا التي LI مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 3. يتم استخراج فرز DOC التي تستجيب الخلايا (خلايا مرحبا) لتحديد الحمض النووي وتصنيفيا عن طريق الجينات 16S الرنا الريباسي اللاحقة المستندة إلى تحليلات بما PCR ، استنساخ بناء مكتبة والتسلسل.
نهجنا إدماج BrdU الأزواج ، وFACS 16S rDNA تحليل للسماح الأنواع على مستوى تحديد الهوية من العوالق البكتيرية التي استقلاب العناصر الفردية DOC في البيئات المائية. في مقايسة التأسيس BrdU التسميات الخلايا البكتيرية على أساس الأنشطة الأيضية ، والذي يسمح فقط على تحليل البكتيريا النش…
The authors have nothing to disclose.
تم توفير التمويل لهذا المشروع الوطني للعلوم OCE1029607 منح مؤسسة (لXM) وMCB0702125 (لمام) وغوردون وبيتي مور مؤسسة (لمام).
Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |