Summary
환경 bacterioplankton는 유기 탄소 (DOC) 화합물과 DNA 라벨 시약, bromodeoxyuridine (BrdU)를 해산 모델 incubated 있습니다. 그 후, DOC - 굴욕적인 세포는 형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여 고가 BrdU의 설립에 따라 대량 지역 사회에서 분리됩니다. 이러한 전지는 다음 이후의 분자 분석에 의해 식별됩니다.
Abstract
미생물이 수중 환경에서 다수의 용해 유기 탄소 (DOC) 기판의 저하를 중재 주요 수단이된다. 그러나, 자연 DOC의 특정 풀을 변형 박테리아 taxa의 식별은 기술적인 도전을 포즈.
여기서 우리는 접근 방식을 설명하는 것을 커플 bromodeoxyuridine (BrdU) 정관, 형광 활성 세포 분류 (외과), 그리고 16 수생 환경에서 굴욕 특정 DOC 화합물 가능한 bacterioplankton 문화 독립적인 식별이 가능 rRNA 유전자 기반의 분자 분석. 세중의의 bacterioplankton의 microcosms은 BrdU와 모델 DOC 화합물 (DOC 개정) 또는 전용 BrdU (노 또한 컨트롤)를 모두 받도록 설정되었습니다. 새로 합성된 박테리아 DNA와 BrdU - 라벨 DNA의 thymidine의 BrdU의 대용품이 순위는 쉽게 immunodetected 1,2 수 있습니다. 추가 DOC 화합물을 선택적으로 활성화 될 것으로 예상하고, 따라서에서 노 DOC의 개정과 세포에 비 응답 전지보다 BrdU의 설립 높은 수준의 (HI 세포)를 가지고 있습니다 사용할 수 있습니다 24 시간 보육, bacterioplankton 통해 또한 컨트롤 (낮은 BrdU의 설립 세포, LI 전지). 형광 면역 후, HI 전지는 구별하고 육체적으로 형광 활성 세포 분류 (외과) 3 LI 세포 분리. 정렬 DOC - 반응 전지 (HI 세포)의 DNA가 추출 taxonomically PCR, 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 포함하여 rRNA 유전자 기반의 분석 이후 16를 통해 식별됩니다.
Protocol
1. 워터 샘플 처리
- 1 μm의 - 기공 크기의 멤브레인 필터를 통해 필터 10L 환경 물은 큰 입자와 bacteriovores을 제거합니다. 상자 속에 든 대형 유리병에 물을 여과물를 수집합니다.
- 4 ML 신선한 paraformaldehyde 용액 (; 10% PFA)를 포함하는 3 멸균 Eppendorf 튜브 (50 ML)로 전송 36 ML 각 여과물. 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간을위한 부화. 진공 여과에 의해 0.22 - μm의 - 기공 크기의 흰색 멤브레인 필터에 세포를 수집합니다. 진공 여과에 의한 필터를 통해 호수 (PBS)를 인산 버퍼 10 ML를 전달하여 필터를 씻으십시오. 부정적인 컨트롤로 필터를 라벨 및 -20 ° C.에 그들을 저장
단계 1.3-1.4 DOC - 제한 조건을 설정을위한 옵션입니다.
- (5 μm의 NH 4 Club 호텔, 5 μm의 나노 3, 1μM 아니 2 PO 4 최종 농도) 상자 속에 든 대형 유리병에 무기 질소와 인의 혼합물을 추가합니다.
- 가끔 agitations 48 시간 동안 현장의 온도에서 어둠 속에 품어.
2. 소우주 설립과 부화
- microcosms을 설정하는 단계 1.4의 상자 속에 든 대형 유리병에서 800 ML 물 샘플 여섯 1 - L 유리 flasks 각각 입력합니다. 각각의 소우주로 BrdU (10 μm의 최종 농도)을 추가합니다. 잘 섞는다.
- microcosms 세에 한 ML 모델 DOC 화합물 솔루션을 추가, 이들은 DOC의 개정안이 될 것입니다. 세 남아 microcosms로 한 ML 멸균 PBS를 추가, 이들은 노 또한 컨트롤 역할을합니다.
- 보육 흔드는 모든 microcosms을 품어 100 rpm으로 흔들어하면서 현장의 온도에서 어둠 속에 품어.
- 시간 0 점, 8, 16, 24 시간 50 ML 살균 Eppendorf 튜브에 각각의 축소판 및 전송에서 물 샘플 36 ML를 수집합니다. 즉시 수집 튜브에 신선한 PFA 4 ML (10 %)를 추가하고 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간에 대해 숙고하다.
- 필터는 0.22 - μm의 - 기공 크기의 폴리 카보 네이트 막 필터를 통해 세포를 보존. 10 ML PBS로 필터를 씻으십시오. 다음 단계로 바로 진행 또는 -20 ° C.에 필터를 저장
3. BrdU의 설립에 대한해라 면역에
- 상온에서 필터 (DOC 개정 샘플, 노 또한 컨트롤과 부정적인 컨트롤) 해동.
- 라이 소 자임 솔루션 1 ML을 적용합니다 [10 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML 라이 소 자임 흰자위 (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오.
- proteinase K 용액 1 ML 추가 [2 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML proteinase K (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오.
- 1 ML의 exonuclease 솔루션 [exonuclease III (50 U / ML) 5 MM의 MgCl 2, 50 MM 트리스 - HCL] 5 필터에 박테리아 세포를 표지에 추가합니다. 37 품어 ° C를 30 분. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오.
- 제조 업체의 지시에 따라 프레임 씰 배양 챔버 (생물 래드)를 조립.
- 알코올 세척 건조 표면에 살균 블레이드를 사용하여 eighths에 필터를 슬라이스.
- 포셉를 사용하여 하나의 조립 프레임 씰 배양 챔버 (8 프레임 인감 챔버 스가 각 필터 샘플이 필요합니다)에 필터의 여덟째 섹션을 놓으십시오. 세포를 포함하는 필터 부분의 측면 위쪽 얼굴 것입니다. 필터의 뒷면에있는 수분은 슬라이드 필터 막대기를하실 수 있습니다. 필터가 건조되면, 슬라이드에있는 필터 섹션을 배치하기 전에 챔버의 중앙에 diH 2 O의 작은 방울 (2 μl)를 적용할 수 있습니다.
단계 3.8-3.20는 제조 업체의 지침에서 변경 절차에 따라 현장 세포 증식 키트에서 호슈에서 시약을 FLUOS 사용합니다. PBS를 제외하고, 모든 시약은 키트 안에 제공됩니다.
- 균일하게 도장이 적용되면 오버플로가 발생하지 않고 배양 챔버의 전체 필터 부분을 커버하기에 충분한 배양 버퍼 (0.5 % 소 혈청 횐자위, PBS에 0.1 % Tween20) 적용됩니다.
- 배양 챔버 프레임을 통해 폴리 에스테르 프레임 커버를 놓습니다. 단단히 배양 챔버를 밀봉 아래로 누르십시오. 필터 위에 기포를 사용하지 마십시오. 어둠 속에서 실온에서 10 분에 대한 봉쇄 실 품어.
- 폴리 에스테르 도장을 제거하고 배양 챔버 스를 엽니다. (참고 : 챔버를 열고 때로는 슬라이드에서 프레임 인감 끌어 올려서 그 경우에는 다음 단계에 대한 새로운 챔버를 준비..)
- 챔버 한 구석에서 부화 버퍼 아웃 Pipet. 필터와 접촉을 피하십시오.
- 부드럽게 100 μl PBS를 pipetting하여 필터를 세척하고챔버에서 밖으로 3 회.
- 바로 사용하기 전에 제조 업체에서 권장하는 단계를 다음과 같은 안티 - BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 준비합니다.
- Pipet 120 μl 방지 BrdU - FLUOS, 필터에 솔루션을 작업을 균일하게하여 전체 표면을 커버주의한다.
- 새로운 폴리 에스테르 커버와 챔버를 봉인. 필터 위에 공기 방울을 피하십시오. 37 어둠의 챔버를 품어 ° C를 3 시간 동안. 이 단계는 플루오레신 isothiocyanate (FITC)와 현장에서 BrdU 통합의 DNA 라벨을 것입니다.
- 폴리 에스테르 커버를 제거하고 배양 챔버를 엽니다. 안티 BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 밖으로 Pipet. PBS와 필터 3 번 씻으십시오.
- 배양 챔버에서 멸균 표면에 필터를 전송합니다. 멸균 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 필터 섹션을 얇게.
- 2 ML microcentrifuge 튜브, 1 ML PBS를 포함하는 각에 필터 조각을 전송합니다. 단단히 parafilm으로 튜브와 인감을 모자. 37 품어 ° C와 10 분, 200 RPM.
- 5 분 최대 속도 vortexer과 소용돌이로 튜브를 고정합니다. 멸균 15 ML Eppendorf 튜브에 Pipet 뜨는합니다. 5 번 이상을위한 인큐베이션 및 와동의 단계를 반복합니다. 각 샘플에 대해 동일한 15 ML Eppendorf 튜브에 뜨는을 결합합니다. 일반적으로 80 % 세포 현탁액에서 복구할 수 있습니다.
- 4 resuspended 세포와 표면에 뜨는를 저장 ° C. 2 일 이내에 정렬합니다.
4. 외과 분석
BD FACSAria 흐름 cytometer와 해당 소프트웨어에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다.
- 제조 업체에서 권장하는 흐름 cytometer의 다음 단계의 설정을 최적화합니다. 이 알아볼 필요 breakoff 매개 변수와 달콤한 자리를 설정하는 증폭 제어를 조정하고, 실험 쉬스 압력 레이저 지연과 영역 확장 요소를 최적화하고 FSC와 SSC 전압, FSC 임계값, FSC 형광 스케일링, 형광 PMT 전압 설정을 최적화 등
- FITC 측면 분산형 (SSC)의 형광 강도에 따라 흐름 cytometer (FCM)에 부정적인 컨트롤 샘플을 실행합니다. 부정적인 컨트롤에 세포가 FITC - SSC 수집 디스플레이에 의해 시각을 사용할 수 없습니다 때까지 FITC 임계값을 높이십시오.
- 노 또한 제어 샘플을 실행하고 FITC와 SSC 인수에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 모든 세포를 싸주십시오 그리고 "낮은 강도 전지"(LIS)로 지정하기위한 게이트를 정의합니다.
- DOC - 개정 샘플을 실행하고 FITC와 SSC에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 일부 세포는 미리 LI 게이트에 나타납니다. LIS보다 높은 형광 강도를 (그의)가 세포를 묶으 다른 게이트를 정의합니다. 문이 세포의 상대적인 풍부를 볼 수 통계를 수집.
- "정화 한 방울"모드에서 500 μl PBS를 포함하는 컬렉션을 튜브로 정렬 HI 세포. 그의 수가 500,000 카운트에 도달할 때 정렬을 종료할 수 있습니다.
5. 16의 필터 PCR 증폭은 rRNA 유전자를
필터 PCR 절차 Kirchman 외에서 수정 6.
- 흰색에 필터 정렬 세포, 0.22 μm의 - 기공 크기, 25mm 지름, 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터. 멸균 블레이드를 사용하여 어떤 박테리아 세포를 포함하지 필터의 가장자리를 낸다. 8 동등한 크기의 조각으로 필터를 슬라이스.
- 세포가 튜브의 안쪽을 향하고과 PCR 반응 관에 하나의 필터 부분을 넣으십시오. PCR 반응 관에 45 μl PCR 등급 물을 추가합니다. 물 속에 완전히 필터 잠수함.
- 이 호슈 illustra PuReTaq 읽기 - 투 - 고, PCR 반응 관에 PCR 비즈를 간단히 와동을 추가합니다. PCR 반응 튜브의 각으로, 2 μl 같은 27F 및 1492R 7로 순방향 및 역방향 16 rRNA 유전자 primers (0.4 μm의 각 프라이머에 대한 최종 농도)를 각각 추가합니다.
- (선택 사항) adsorb 증폭 억제제를 돕기 위해 PCR 반응 혼합물에 1μl 소 혈청 알부민 솔루션 (BSA, 최종 농도가 30μg/100 μl)을 추가합니다. 한 BSA를 추가하지 선택한 경우, 대신에 물을 1μl 추가할 수 있습니다.
- 열 자전거 타는 사람에 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 프로그램 다운 터치 권장합니다, 이것은 순차적으로 62에서 52로 감소 어닐링 온도를 가지고 ° C 1 ° C 52 어닐링 온도와 15주기에 의해 다음 11주기, ° C.에 대한 사이클당 모든주기는 (95 ° C에서) denaturing (62에서 52 ° C) 어닐링, 및 확장 (72 ° C에서) 50 기간의 단계를 포함합니다. 초기 3 분 변성 및 최종 10 분 확장 단계는 PCR 프로그램에 포함되어 있습니다.
- ethidium 브로마이드 묻은 1퍼센트 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 PCR의 증폭을 확인합니다. 엑사이스 PCR의 겔에서 amplicons 및 QIAGEN QIAquick 겔 추출 키트와 함께 청소하십시오.
- 각 샘플에 대한 두 개의 추가 PCR amplifications을 수행, 각 시간이 새 필터 섹션을 사용합니다. PCR 젤 purificati 후에 함께 동일한 샘플의 amplicons을 수영장. 정화 16 rDNA의 amplicons 지금 같은 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱과 같은 taxonomic 식별을 허용 분자 분석의 여러 준비가되어 있습니다.
6. 대표 결과 :
대표 결과는 예를 들어 putrescine - 굴욕적인 박테리아의 연구를 사용하여 설명되어 있습니다. 물 샘플은 조지아 해안 사이트에서 수집하여 위에서 설명한 절차에 따라 처리되었습니다. 외과 분석 putrescine 또한 높은 BrdU의 설립 속도 (그림 1)을 나타내는 높은 FITC 형광 강도와 박테리아의 그룹의 발전을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 전지는 높은 BrdU - 정관 전지 (그의)으로 지정되었으며 대부분 putrescine - 굴욕적인 박테리아를 포함하는 것으로 예상했다. HIS는 BrdU의 설립 (LIS)의 낮은 수준의 세포가 포함된 노 또한 컨트롤에서 누락되었습니다. LIS는 주로 추가 putrescine를 사용할 수 없습니다 bacterioplankton를 포함할 것으로 예상했다. 그의 분리 튜브에 정렬하고 멤브레인 필터로 수집했다. 16 rRNA 유전자 amplicons는 필터 PCR을 사용하여 높은 HI 세포에 대한 취득했다.
그림 1. 노 또한 제어 및 부화 후 24 H 수집 (여기서 예로 putrescine) 모델 화합물 - 개정 표본의 흐름 cytometric 분석. 세포 분포 분석은 긍정적으로 BrdU의 정관의 수준과 관련이 FITC 라벨 (X 축) (1) 형광 강도에 따라 있었고, (2) 사이드 분산형 (SSC, Y 축)은, 긍정적으로 세포에 관련된 어떤 크기. 게이트 표기법은 BrdU의 설립, (; LI, 낮은 BrdU - 정관 HI, 높은 BrdU - 정관)의 수준에 따라 달라집니다. HI 및 LI 세포의 상대적 비율은 해당 게이트에 표시됩니다.
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Discussion
우리의 접근 커플 BrdU의 설립, 외과 및 16 rDNA 분석 수생 환경에서 개별 DOC 구성 요소를 대사 bacterioplankton의 종 수준의 식별을 허용합니다. BrdU의 설립 분석은 활성 세균에 대한 분석이 가능하기 때문에 휴면 세포를 포함하지 않습니다 신진 대사 활동을 기반으로 박테리아 세포를 표시합니다. 우리의 접근에서 BrdU의 설립은 이후 시각 아르 BrdU의 설립의 다른 수준을 가지고 immunodetected 현장과 박테리아의 그룹화 및 외과를 사용하여 정렬됩니다. BrdU 통합 세포의 분석은 또한 분자 분석 2,8,9 다음 BrdU - 라벨 DNA의 자기 비드 immunocapture를 사용하여보고되었습니다. 후자 방법 중 하나는 제한이 다른 활동 수준의 세포를 구별하기 위해 못하는 것입니다. 이 경우에는 분석 (그림 1, LIS) 물 샘플에서 원주민 DOC를 사용하여 약간 활성 상태로 유지 세포를 포함하게됩니다.
결합 방식은 같은 dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, 해안 해수의 글리신의 베타인 3 등 DOC 화합물이 저하될 수 있습니다 박테리아의 taxonomic 구조를 식별하는 데 사용되었습니다. 그 응용 프로그램은 크게 수생 환경에서 다른 단일 또는 혼합 용해 기판을 사용하여 박테리아의 분류 연구를 추정 수 있습니다. 16 rRNA 유전자 이외에 기능성 유전자 마커도 마찬가지로 분석하실 수 있습니다. 정렬 세포에 대한 분자 분석은 일반적으로 이하 1,000,000 세포는 정렬 세포의 작은 풍부한으로 인해 도전이다. 따라서, DNA 템플릿 증폭는 일반적으로 더 분자 분석을 위해 필요합니다. 셀 수량에 제한이 있지만, 사회 구조의 충분한 해상도는 일반적으로 얻어진다. 연구 지역 사회의 손가락이 2000 셀 (~ 1 μl 해수)만큼 낮은 터미널에서 제한 조각의 길이 다형성 (T - RFLP)에 의해 주로 10 연안 해수에서 2x10 9 셀 (~ 1 L의 해수)에서 생성된 해당 유사를 생성 인쇄 것을 증명하고있다. PCR을 사용하여 단일 유전자 증폭과 더불어, 정렬 세포의 metagenomic 분석이 아닌 PCR 기반의 게놈의 증폭 기술, 즉 여러 변위 증폭, MDA 11를 통해 가능합니다.
중요 단계
microcosms과 장기 배양을 피해야한다 외부 DOC 화합물의 과도한 양의 자연, 이외에 가까운 조건을 유지합니다. 예비 실험은 매우 비교적 짧은 시간 (<72시간)에서 HI 세포의 개발을 유도하는 데 필요한 모델 DOC 화합물의 가장 낮은 금액을 결정하는 것이 좋습니다. 긴 배양 시간은 microcosms의 병 - 효과의 개발의 우려를 인상 수 있습니다. 무기 N과 P로 사전 배양은 선택 사항이지만, DOC의 HI 세포의 개발 microcosms을 개정 필요합니다 부화 시간의 길이를 단축하는 데 도움이 될 수 있습니다.
BrdU 면역 형광 전에 세포 고정을위한 조건 매우 중요합니다. 부족 고정은 (라이 소 자임과 proteinase K 처리) 세포 벽 permeabilization 단계 동안에 세포의 손실을 초래하게됩니다. 한편, 이상 보존된 세포가 필터 - PCR 증폭을위한 DNA 템플릿을 lyse 놓아 너무 딱딱한 경향이 있습니다. 보존료, 방부제 농도 및 보존 시간 길이의 선택은 연구 세균성 지역 사회를위한 최적화해야합니다. 이 프로토콜에 나열된 보존 절차는 크게 알파 및 감마 - 제트 10 Proteobacteria에 의해 지배되는 해안 해양 bacterioplankton 커뮤니티에 최적화된되었습니다.
BrdU 면역 여러 단계는 멤브레인 필터에서 수행됩니다. 주의 필터를 건조여 않도록 주의해야한다. 이상 건조 필터 탈수 세포 강력히 필터 세포막에 연결 수 있으며 나중 외과 분석 resuspend하기 어려울 것입니다. BrdU 면역 전후 세균의 세포 카운트는 항상 세균 세포의 복구 속도를 결정하기 위해 측정해야합니다.
필터 - PCR 6 수행할 때, PCR 시약의 볼륨은 전적으로 잠수함 필터 기사를 충분히해야합니다. 일반적으로 최적화된 핫 시작하고 터치 다운 PCR 프로그램은 좋은 유전자 증폭을 생산하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 PCR 최적화는 +, BSA 및 기타 재료를 PCR 최적화 키트 (예 : EPICENTRE 안전 PCR 시스템 등)을 사용하거나 MG 2의 농도를 조작하여 수행할 수 있습니다.
방법 제한
이 결합된 접근 방식은 잠재적으로 특정 기판을 저하시킬 수 및 문화 독립적으로 상세 taxonomic 레벨 이러한 기능성 세포를 식별할 수 있습니다 박테리아의 컬렉션을 수 있습니다. 그러나, 몇 가지 고려 사항은 AC로 이동해야합니다결과를 해석하면 계산합니다. 접근 방식은 일반적으로 유리병에 비 추적 수준에서 특정 화합물, 천연 bacterioplankton의 인큐베이션으로 시작합니다. 기능 assemblages로 식별 전지는 현장 조건 아래에 주어진 화합물 (들)을 처리하시는 분들은 다를 수 있습니다. BrdU의 정관 일부 세균 1,2에 대한 탐지로 발견되었습니다. 이러한 박테리아는 않으므로,이 방법을 사용하여 액세스할 수 없습니다. 직접 복합 열화에 참여했지만 추가 화합물 (S)의 저하 제품을 받아되지 않은 박테리아의 진정한 degraders에서 구별할 아르 허위 - 긍정적인 신호를 줄 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트의 자금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 부여 OCE1029607 (XM)을하고 MCB0702125 (MAM)을하고 고든과 베티 무어 재단 (MAM)을 제공한했습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma-Aldrich | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma-Aldrich | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche Group | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | Qiagen | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | Epicentre Biotechnologies | FS99060 |
References
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