Bactérioplancton environnement sont incubés avec un modèle de carbone organique dissous (DOC) composé et un réactif de marquage de l'ADN, bromodésoxyuridine (BrdU). Ensuite, DOC-dégradants cellules sont séparées de la communauté en vrac en fonction de leur incorporation de BrdU élevée en utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS). Ces cellules sont ensuite identifiés par des analyses moléculaires ultérieures.
Les microbes sont les principaux agents de médiation de la dégradation de nombreuses carbone organique dissous (DOC) des substrats dans les milieux aquatiques. Toutefois, l'identification des taxons bactériens qui transforment les piscines spécifiques de COD dans la nature pose un défi technique.
Nous décrivons ici une approche qui couple bromodésoxyuridine (BrdU) l'incorporation, tri cellulaire par fluorescence (FACS), et ARNr 16S basée sur l'analyse moléculaire qui permet l'identification indépendante de la culture du bactérioplancton capables de dégrader un composé DOC spécifiques dans les milieux aquatiques. Microcosmes bactérioplancton en triple sont mis en place pour recevoir les deux BrdU et un composé modèle de DOC (DOC amendements), ou seulement BrdU (sans ajout de contrôle). Substituts BrdU les positions de la thymidine dans l'ADN bactérien nouvellement synthétisé et BrdU marqué l'ADN peut être facilement immunodétectée 1,2. Grâce à une incubation de 24 h, bactérioplancton qui sont capables d'utiliser le composé ajouté DOC devraient être activés sélectivement, et ont donc des niveaux plus élevés d'incorporation de BrdU (cellules HI) que les non-réactive les cellules dans les modifications du DOC et les cellules dans un no- Outre les contrôles (faible incorporation de BrdU cellules, les cellules LI). Après immunodétection de fluorescence, les cellules HI sont distingués et physiquement séparé des cellules LI par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 3. Tri DOC-réactive (cellules HI) sont extraits de l'ADN et taxinomique identifiés par 16S ARNr ultérieure basée sur des analyses, y compris la PCR, la construction de bibliothèques clone et le séquençage.
Notre approche de couples BrdU constitution, FACS et 16S ADNr pour permettre l'analyse des espèces au niveau d'identification du bactérioplancton qui métabolisent les composants individuels du DOC dans les milieux aquatiques. Le dosage de l'incorporation de BrdU étiquettes des cellules bactériennes en fonction des activités métaboliques, ce qui permet l'analyse uniquement sur les bactéries actives et ne comprennent donc pas des cellules dormantes. Dans notre approche, l'incorporation de BrdU …
The authors have nothing to disclose.
Le financement de ce projet a été fournie par la National Science Foundation accorde OCE1029607 (XM) et MCB0702125 (au MAM) et la Gordon and Betty Moore Foundation (au MAM).
Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |