Summary
环境浮游细菌培养与溶解有机碳（DOC）的化合物和一个DNA标记试剂，溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的一种模式。随后，商务部降解细胞分离升高BrdU使用荧光激活细胞分选（FACS）纳入散装社会。随后的分子分析这些细胞，然后确定。
Abstract
微生物介导许多溶解的有机碳（DOC）基板在水生环境退化的主要代理商。然而，鉴定，改造大自然的DOC的具体池的细菌类群构成一个技术上的挑战。
在这里，我们描述了一个方法，夫妇溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）掺入，荧光激活细胞分选（FACS），和16S rRNA基因的分子分析功能，使文化有辱人格的特定DOC的化合物在水生环境的浮游细菌能够独立识别。设置为接收BrdU和模型DOC化合物（DOC修订），或只BrdU（不加控制）一式三份浮游细菌的缩影。 BrdU替代品在新合成的细菌的DNA和BrdU标记的DNA的胸苷的位置可以随时immunodetected 1,2。通过一个24小时孵化，浮游细菌，可以使用添加的DOC复合预计将有选择地激活，因此有较高水平的BrdU掺入比在DOC的修订和细胞非反应细胞（您好细胞）在无除了控制（低BrdU掺入细胞，李细胞）。荧光免疫检测后，您好细胞区分和身体从李细胞分离，荧光激活细胞分选（FACS）3 。排序DOC - 反应的细胞（您好细胞）的DNA提取和分类学上通过随后的16S rRNA基因为基础的分析，包括PCR，克隆库的建设和测序鉴定。
Protocol
1。水样加工
- 通过1微米孔径的过滤膜过滤器10L环境用水，以去除大颗粒和bacteriovores。水滤液收集在一个carboy。
- 转让36毫升滤液每到3无菌Eppendorf管中含有4毫升新鲜配制的多聚甲醛溶液（PFA 10％）（50毫升）。在室温下孵育2小时，以保持细胞。收集到0.22微米孔径的白色膜过滤器真空过滤的细胞。通过真空过滤的过滤器10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗过滤器。标签作为阴性对照的过滤器，并把它们存放在-20 ° C
步骤1.3-1.4建立DOC -有限的条件下是可选的。
- 添加（5微米的NH 4 CL，5微米NANO 3，和1μM的NaH 2 PO 4决赛中浓度）到carboy无机氮和磷的混合物。
- 在现场温度孵育偶尔鼓动48小时在黑暗中。
2。建立和孵化缩影
- 装满800毫升水样从第1.4步建立的缩影carboy每6个1 - L玻璃烧瓶。加入BrdU，终浓度为（10微米），每个缩影。拌匀。
- 添加1毫升模型DOC复合解决方案分为三个缩影，这些将作为商务部修订。 1毫升无菌PBS添加到剩下的三个缩影，这些将作为无除了控制。
- 在一个孵化器中孵化的缩影和孵化在现场温度在黑暗中晃动，而在100转。
- 从每一个缩影和转让到50毫升无菌Eppendorf公司在时间点0，8，16，和24小时的管收集36毫升的水样。立即加入4毫升新鲜煤灰（10％）收集管和孵育2小时在室温下保存的细胞。
- 通过0.22微米孔径的聚碳酸酯膜过滤器过滤器保存的细胞。用10 ml PBS冲洗过滤器。立即着手下一步或存放于-20 ° C的过滤器
在原位免疫检测BrdU掺入3。
- 在室温下解冻的过滤器（商务部修订的样品，不加控制和阴性对照）。
- 应用溶菌酶溶液1毫升10毫克/毫升溶菌酶蛋清在100毫米，50纳米EDTA的Tris（PH = 8）] 4覆盖过滤器上的细菌细胞。在室温下孵育30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
- 添加蛋白酶K溶液1毫升[2 mg / ml的蛋白酶K在100毫米，50纳米EDTA的Tris（PH = 8）] 4覆盖过滤器上的细菌细胞。在室温下孵育30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
- 加入1毫升的核酸外切酶的解决方案[核酸外切酶III（50 U / ml）的氯化镁 2 5毫米和50毫米的Tris - HCl] 5到过滤器上的细菌细胞。 37 ° 30分钟。通过下吸10毫升PBS冲洗过滤器。
- 根据制造商的指示组装框架密封孵化室（BIO - RAD）。
- 酒精清洁干燥的表面上使用无菌刀片切成八分过滤器。
- 使用镊子，放入一个组装框架密封孵化室（每个过滤器样品需要8帧密封腔）第八部分的过滤器。过滤器部分包含单元格方应朝上。过滤器的背面的水分，将允许过滤棒的幻灯片。如果过滤器变得干燥，适用于DIH 2澳商会中心在幻灯片上的过滤器部分一个小滴（2μL）。
步骤3.8-3.20使用罗氏原位细胞增殖试剂盒的试剂，FLUOS从制造商的指示修改的程序。 除对PBS，所有的试剂套件内提供。
- 施加足够的孵育缓冲液（0.5％，0.1％Tween20的PBS，牛血清蛋白），均匀地覆盖整个孵化室的过滤器部分，而不会造成溢出，一旦密封。
- 聚酯放置在孵化室帧帧盖。按上下紧紧密封的孵化室。以上的过滤器，避免气泡。为在室温下在黑暗中10分钟孵育密封腔。
- 删除聚酯密封，打开孵化室。 （注：开放的商会，有时会拉起来的帧从幻灯片密封在这种情况下，准备一个新腔以下步骤。）
- 吸取了孵化室的一个角落缓冲区。避免接触过滤器。
- 轻轻吹打100μLPBS冲洗过滤器和从会议厅出来的3倍。
- 准备抗BrdU - FLUOS以下步骤使用前制造商建议的工作解决方案。
- 吸取120μL抗BrdU FLUOS工作到过滤器的解决方案，照顾到均匀地覆盖整个表面。
- 与一个新的聚酯盖重新密封腔。避免过滤器顶部的气泡。室在黑暗中在37 ° C为3小时。这一步将在原地异硫氰酸荧光素（FITC）标记BrdU纳入DNA。
- 删除聚酯盖，打开孵化室。吸取了抗BrdU - FLUOS工作液。用PBS清洗过滤器的3倍。
- 将过滤器从孵化室，无菌的表面。切片成小块用消毒的刀片的过滤器“部分。
- 转移到2 ml离心管，每片含1毫升PBS的滤波器件。紧瓶盖的封口膜管和密封。在37 ° C和10分钟200转。
- 安全和最高速度为5分钟到一个vortexer涡管。吸取上清液到15毫升无菌Eppendorf管。重复5次以上的孵化和涡步骤。结合在同一15 ml Eppendorf管中，每个样品的上清液。通常情况下，80％的细胞可以恢复暂停。
- 商店取上清液，重悬细胞在4 ° C。 2天之内进行排序。
4。流式细胞仪分析
这里描述的是一个BD FACSAria流式细胞仪和相应的软件程序。
- 优化制造商所建议的流式细胞仪以下步骤设置。这就要求：调整放大控制，设置所需的片断参数和甜蜜点;优化实验鞘压力的激光延迟和面积换算因子，FSC和SSC，FSC的阈值电压，FSC荧光缩放，荧光光电倍增管电压优化设置等
- 基于FITC和侧散射（SSC）的荧光强度流式细胞仪（FCM）上运行的阴性对照样品。增加的FITC标记的阈值，直到阴性对照无细胞可以FITC - SSC采集显示的可视化。
- 运行不加控制样品和研究万细胞FITC和SSC收购的分布格局。定义一个门，附上所有的细胞，并指定为“低强度的细胞”（LIS）。
- 运行DOC修订的样品和研究基于FITC和SSC万细胞的分布格局。有些细胞会出现在预设的李门。定义另一个门附上的细胞，具有较高的荧光强度比LIS（他）。获得统计数据，以查看门细胞的相对丰度。
- 排序您好细胞，成集合，其中包含500μLPBS管“净化1滴”模式。终止排序时，他的人数达50万计数。
5。筛选PCR扩增16S rRNA基因
过滤PCR程序修改Kirchman等。
- 筛选到一个白色的排序细胞，0.22微米孔径，25毫米直径，聚碳酸酯滤膜过滤。剪掉的过滤器，不包含任何使用无菌刀片的细菌细胞的边缘。切成8个同等大小的块过滤器。
- 到PCR反应管中放置一个单一的过滤片，与细胞面临着外来的管。 PCR反应管中加入45μLPCR级水。淹没的过滤器完全在水中。
- 2罗氏插图PuReTaq阅读到进入PCR反应管PCR珠，简要旋涡。添加正向和反向的16S rRNA基因的引物（0.4微米每个引物终浓度），如27F和1492R 7各2μL，每个PCR反应管中。
- （可选）添加加入1μl牛血清白蛋白溶液（BSA，终浓度是30μg/100μL）的PCR反应，以帮助吸附放大抑制剂。如果选择不添加牛血清白蛋白，加水加入1μl。
- 进行PCR扩增热循环仪上一个。一个触摸下来PCR程序的建议，其中的退火温度，比上一季度减少62至52 ° C时为1 ° C，每循环11周期由15个循环，退火温度52 ° C。所有循环包括变性（95℃），退火（62至52℃）和扩展（72℃）50年代的持续时间步骤。 PCR程序也包括在最初的3分钟变性和最后的10分钟延长步骤。
- 溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增。海关从凝胶中的PCR扩增和凯杰QIAquick凝胶提取试剂盒的清洁。
- 每个样本执行两个额外的PCR扩增，每次使用一个新的过滤器“部分。经过PCR凝胶purificati上，池同一样品的扩增产物。纯净16S rDNA的扩增产物，现在准备允许分类鉴定，如克隆库的建设和测序，分子生物学分析。
6。代表性的成果：
代表使用为例，腐胺降解菌的研究结果说明。从格鲁吉亚沿海现场采集水样，并按照上述程序进行处理。流式细胞仪分析显示，腐胺除了诱发高FITC荧光强度的细菌集团的发展，说明高BrdU掺入率（图1）。这些细胞被指定为高BrdU掺入细胞（他），预计包含大多为腐胺降解菌。他在不加控制，只包含与下级BrdU掺入（LIS）的细胞缺少。 LIS，预计主要包括浮游细菌，无法使用添加腐胺。他整理成分离的导管，然后到膜过滤器收集。获得高您好使用过滤器PCR细胞16S rRNA基因扩增产物。
图1。流量没有除了控制和孵化24小时后收集的样品模型化合物的修订（腐胺作为一个例子）流式细胞仪分析。细胞分布的分析是基于（1）的FITC标记（X轴），这是正相关，BrdU掺入水平的荧光强度，（2）侧散射（SSC，Y轴），这是正相关的细胞大小。门符号是基于BrdU掺入，（高，高BrdU掺入，李，低BrdU的掺入）的水平。 HI和李细胞相对百分比显示在相应的门。
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Discussion
我们的做法夫妇BrdU掺入，流式细胞仪和16S rDNA序列分析，让物种一级的浮游细菌的代谢水环境中的个人的DOC组件的识别。 BrdU掺入检测标签的细菌细胞的代谢活动，只允许对活性细菌的分析，因此不包括休眠细胞。在我们的方法， 在原位 immunodetected和细菌有不同层次的BrdU掺入BrdU掺入随后可视化，使用流式细胞仪进行分组和排序。的BrdU纳入细胞的分析也有报道使用的BrdU标记的DNA磁珠immunocapture 2,8,9分子分析。后者方法的一个限制是它无法区分不同活动水平的细胞。分析将包括在这种情况下，仍然使用的水样中土著的DOC（图1，LIS）仅略有活跃的细胞。
耦合方法已被用于识别细菌能降解如dimethylsulfoniopropionate（DMSP），香草，甘氨酸甜菜碱沿海海水3 DOC化合物的分类结构。它的应用可大致推断，研究细菌在水环境中使用的其他单一或混合溶解基板的分类。除了16S rRNA基因，功能基因标记也可以得到同样的分析。排序细胞的分子分析是由于排序的细胞，通常是小于1万细胞小丰挑战。因此，DNA为模板扩增，通常需要作进一步的分子分析。虽然在细胞数量有限，社会结构的足够高的分辨率通常是获得。有研究表明，社区的指纹终端限制性片段长度多态性（T - RFLP）从2000细胞（约1μL海水），在很大程度上类似于 2X10 9细胞（约1升海水）在10个沿海海水产生的。除了 单用PCR基因扩增，排序细胞的宏基因组的分析是可能的，通过一个基于非PCR基因扩增技术，即多重置换扩增 ，丙二醛11。
关键步骤
为了保持接近自然，除了过量的外部DOC化合物的缩影和应避免长时间的潜伏期的条件。初步实验，强烈建议，以确定模型DOC化合物诱导您好细胞的发展，在较短的时间内（<72小时）所需的最低金额。潜伏期较长时间，可能会提高发展的缩影瓶效应的关注。预培养与无机氮和磷是可选的，但可能有助于缩短孵化时间的长度，是商务部您好细胞的发展需要修订的缩影。
细胞BrdU荧光免疫检测前固定的条件是极为重要的。固定不足将导致细胞的损失（溶菌酶和蛋白酶K处理）在细胞壁通透性步骤。另一方面，超过保存完好的细胞往往过于僵化，以溶解和释放过滤器- PCR扩增DNA模板。防腐剂，防腐剂浓度和保存时间长短的选择应为研究细菌群落进行了优化。在本议定书中所列的保护程序进行了优化，为沿海海洋浮游细菌的社会，在很大程度上是由变形菌为主的α-和γ-下属10。
膜过滤器上执行多个步骤的BrdU免疫检测。时应注意避免过度干燥过滤器。脱水细胞过度干燥过滤器可能会强烈地附着于滤膜，然后将很难重悬，后来FACS分析。 BrdU免疫检测前，后的细菌细胞计数应始终测量，以确定细菌细胞的回收率。
在进行过滤器- PCR检测6，PCR试 剂的量应该是足够的过滤片完全淹没。一个优化的热启动和触摸式PCR总体规划，将有助于产生良好的基因扩增。可以进行进一步的PCR技术的优化使用的PCR优化套件（如震中故障安全PCR系统）或操纵浓度的Mg 2 +，BSA和其他成分 。
方法的局限性
这种耦合方法允许收集细菌，可以潜在地降低一个特定的基板和文化自主确定详细的分类级别，这些功能的细胞。然而，几方面的考虑，应考虑到AC解释结果时计数。这种方法启动与特定的化合物，通常是在非示踪水平玻璃瓶，自然浮游细菌的潜伏期。确定为功能组合的细胞可能不同于那些过程中的化合物（S）在原位条件下。 BrdU掺入已发现一些细菌1,2检测不到的。这些细菌，因此，使用这种方法是不可访问的。不直接参与化合物降解，但添加化合物（S）的降解产物的细菌可能会是无法区分真正降解菌的假阳性信号。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目的经费是由国家科学基金会资助OCE1029607（XM）和MCB0702125（MAM），戈登和贝蒂摩尔基金会（MAM）的。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma-Aldrich | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma-Aldrich | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche Group | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | Qiagen | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | Epicentre Biotechnologies | FS99060 |
References
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