Bacterioplankton הסביבה מודגרת עם מודל מומס פחמן אורגני (DOC) המתחם מגיב תיוג DNA, bromodeoxyuridine (BrdU). לאחר מכן, DOC-משפיל תאים מופרדים מן הקהילה בתפזורת מבוסס על שילוב גבוהות BrdU שלהם באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS). תאים אלה מזוהים מכן על ידי מנתח מולקולרית שלאחר מכן.
חיידקים הם סוכני התיווך העיקריים את ההשפלה של פחמן אורגני מומס רבים (DOC) מצעים בסביבות מימיים. עם זאת, זיהוי מינים חיידקים שהופכים בריכות ספציפיים של DOC בטבע מהווה אתגר טכני.
כאן אנו מתארים גישה זוגות bromodeoxyuridine (BrdU) ההתאגדות, תא הקרינה מיון מופעל (FACS), ו – 16S rRNA ניתוח מולקולרי גנטי המבוסס המאפשר תרבות עצמאית זיהוי bacterioplankton מסוגל מתחם DOC משפיל ספציפי בסביבות מימיים. Bacterioplankton מיקרוקוסמוס בשלושה עותקים מוגדרים לקבל הן BrdU ו תרכובת DOC מודל (DOC תיקונים), או רק BrdU (ללא תוספת שליטה). תחליפי BrdU עמדות thymidine ב-DNA חיידקי מסונתז החדש ו-BrdU שכותרתו DNA ניתן 1,2 immunodetected בקלות. באמצעות bacterioplankton 24 שעות דגירה, כי הם מסוגלים להשתמש במתחם הוסיף DOC צפויים להיות מופעלים באופן סלקטיבי, ולכן יש רמות גבוהות יותר של שילוב BrdU (תאים HI) מאשר אי – היענות תאים התיקונים DOC ו תאים ללא בנוסף שולטת (נמוך תאים BrdU ההתאגדות, תאים LI). לאחר immunodetection פלואורסצנטי, HI תאים נבדלים ו מופרדים פיזית על ידי מיון הקרינה התא הפעיל (FACS) 3 מתאי LI. ממוין DOC-מגיבים תאים (תאים HI) המחולצים עבור דנ"א שזוהו טקסונומית באמצעות 16S rRNA הבאים הגן מבוססי ניתוח כולל PCR, שיבוט בנייה ספריה וסדר.
זוגות הגישה שלנו ההתאגדות BrdU, FACS ו 16S ניתוח rDNA כדי לאפשר זיהוי ברמת המין של bacterioplankton כי לעכל רכיבים בודדים DOC בסביבות מימיים. Assay ההתאגדות BrdU תוויות תאים חיידקיים מבוסס על פעילות מטבולית, המאפשר ניתוח רק על חיידקים פעילים, ולכן אינה כוללת תאים רדומים. בגישה שלנו, ההתאגד?…
The authors have nothing to disclose.
מימון פרויקט זה סופק על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים OCE1029607 (עד XM) ו MCB0702125 (אל MAM) ואת גורדון ובטי מור קרן (אל MAM).
Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |