Milieu-bacterioplankton worden geïncubeerd met een model opgeloste organische koolstof (DOC) verbinding en een DNA-etikettering reagens, broomdeoxyuridine (BrdU). Daarna zijn DOC-afbrekende cellen gescheiden van de bulk-gemeenschap op basis van hun verhoogde BrdU incorporatie met behulp van fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS). Deze cellen worden vervolgens geïdentificeerd door de volgende moleculaire analyses.
Microben zijn belangrijke agenten bemiddelen de afbraak van een groot aantal opgeloste organische koolstof (DOC) substraten in het aquatisch milieu. Echter, de identificatie van bacteriële taxa die specifieke zwembaden van DOC te transformeren in de natuur vormt een technische uitdaging.
Hier beschrijven we een aanpak die paren broomdeoxyuridine (BrdU) incorporatie, fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en 16S rRNA-gen op basis van moleculaire analyse van de cultuur-onafhankelijke identificatie van bacterioplankton in staat vernederende een specifieke DOC compound in het aquatisch milieu mogelijk maakt. Drievoud bacterioplankton microkosmossen zijn ingesteld om zowel BrdU en een model DOC verbinding (DOC amendementen), of alleen BrdU (no-toevoeging controle) te ontvangen. BrdU vervangt de posities van thymidine in nieuw gesynthetiseerde bacteriële DNA en BrdU-gelabeld DNA kan gemakkelijk immunodetected 1,2 te zijn. Door middel van een 24-uurs incubatie bacterioplankton die in staat zijn om gebruik maken van de toegevoegde DOC compound wordt verwacht dat ze selectief worden geactiveerd, en dus hogere niveaus van BrdU incorporatie (HI cellen) dan niet-ontvankelijk cellen in de DOC wijzigingen en cellen in no- Naast controles (lage BrdU incorporatie cellen, LI-cellen). Na de fluorescentie immunodetectie, zijn HI cellen onderscheiden en fysiek gescheiden van de LI cellen door fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) 3. Gesorteerd DOC-responsieve cellen (HI-cellen) zijn gewonnen voor DNA en taxonomisch geïdentificeerd door middel van de volgende 16S rRNA gen-gebaseerde analyses waaronder PCR, klonen bibliotheek bouw en sequencing.
Onze aanpak koppels BrdU incorporatie, FACS en 16S rDNA analyse soort-niveau identificatie van bacterioplankton dat de afzonderlijke DOC componenten metaboliseren in het aquatisch milieu mogelijk te maken. De BrdU incorporatie assay labels bacteriële cellen op basis van metabolische activiteiten, die analyse maakt het mogelijk alleen op actieve bacteriën en dus bevat geen slapende cellen. In onze aanpak, BrdU incorporatie is in situ immunodetected en bacteriën die verschillende niveaus van BrdU incorporatie …
The authors have nothing to disclose.
Financiering van dit project werd verzorgd door de National Science Foundation verleent OCE1029607 (tot XM) en MCB0702125 (tot MAM) en de Gordon en Betty Moore Foundation (tot MAM).
Name | Type | Company | Catalog number | Comments |
BrdU | Reagent | Sigma | B5002-5G | |
Lysozyme | Reagent | Sigma | L6876-5G | |
Proteinase K | Reagent | Sigma | P2308-25MG | |
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | Millipore | FALP14250 | |
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | Millipore | FGLP02500 | |
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
QIAquick gel extraction kit | Kit | QIAGEN | 28704 | |
FailSafe PCR System | Kit | EPICENTRE | FS99060 |