从现场收集到的蚊子传染病毒Vero细胞培养法检测
Summary
我们描述了一个方法来处理和屏幕现场收集到的蚊子的病毒Vero细胞培养法的多样性。通过采用这种技术的，我们已检测到4个分类家庭在康涅狄格州收集蚊子的9种不同的病毒。
Abstract
蚊子都传播了不同的病毒，包括重要的人类病原体，如西尼罗河病毒，登革热病毒，和chickungunya病毒的数量。许多这些病毒已加强在其流行范围扩大到新界，需要有效的监测和控制方案，以应对这些威胁。监控病毒活动的一个战略涉及从流行网站收集大量的蚊子和测试病毒感染。在这篇文章中，我们描述了如何处理的过程中，屏幕现场收集Vero细胞培养法对传染性病毒的蚊子。由陷阱的位置和物种的蚊子进行排序，并归纳为含≤50个人的池。汇集标本匀浆缓冲使用混频器厂和水相融合Vero细胞培养（克隆E6）到接种生理盐水。细胞培养监测3-7后接种在细胞培养中生长的任何病毒是通过适当的诊断方法确定天的细胞病变效应。利用这种方法，我们已经分离出9种不同的病毒，在美国康涅狄格州收集蚊子，其中，5个是已知的导致人类疾病。这三种病毒（波托西病毒，西尼罗河病毒，和拉克罗斯病毒）代表北美新英格兰地区自1999年以来的新纪录。能够检测到的病毒的广泛的多样性是至关重要的监测建立和新出现的病毒在蚊子种群。
Protocol
1。蚊子排序和识别在一个专门的生物安全2级（BSL – 2）的工作人员是受过训练的工作与生活的蚊子实验室，开放实验室长凳上执行下列程序。整个过程中保持一个“冷链”。 麻醉住成蚊，灭蚊收集袋放置在-20℃冷冻5分钟。收集袋转移到一个绝缘容器干冰。关闭盖子，并揭露蚊子，以二氧化碳为1-3分钟，以确保完成击倒。 到病床上的干冰置于预冷的泛塔麻醉蚊子。单独用细?…
Discussion
Vero细胞培养法作为一种有效的方法现场收集的病毒的多样性屏幕蚊子。这种专门针对一个或几个病毒的分子生物学方法的对比。此外，我们发现Vero细胞培养法，同样如果不是更多的7比RT – PCR检测的敏感，并为我们提供了为今后的研究中，储存在我们的参考收集的病毒株。然而，细胞培养系统可能无法在许多情况下，适当的。这种做法会带来额外的费用和培训，要求在BSL – 3实验室中生长?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢博士的重要贡献。约翰安德森，安德鲁主要和Shirley蒂雷尔这项研究。这项工作是支持部分由从疾病控制和预防中心（U50/CCU116806-01-1）和美国农业部（58-6615-1-218，CONH00768，CONH00773）中心的拨款。
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
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Infectious VirusField-collected MosquitoesVero Cell Culture AssayWest Nile VirusDengue VirusChickungunya VirusSurveillance And Control ProgramsViral InfectionTrap LocationSpecies GroupingPooled SpecimensBuffered SalineMixer-millVero Cell CulturesCytopathic EffectDiagnostic AssaysVirus IsolationConnecticut USAHuman DiseaseNew Records
Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).