Summary
Vi beskriver en metod att bearbeta och skärm fältet samlas in myggor för en mångfald av virus genom att Vero cellodling analys. Genom att använda denna teknik har vi upptäckt 9 olika virus från 4 taxonomisk familjer i myggor samlats i Connecticut.
Abstract
Myggor överföra ett antal olika virus, inklusive viktiga mänskliga patogener som West Nile virus, denguefeber virus och chickungunya virus. Många av dessa virus har intensifierats i endemiska områden och utvidgas till nya områden, vilket kräver effektiv övervakning och kontroll program för att möta dessa hot. En strategi för att övervaka virusaktivitet skall hämtas stort antal myggor från endemiska områden och testa dem för virusinfektion. I den här artikeln beskriver vi hur man hantera, bearbeta, och skärmen på fältet in myggor för smittsamma virus genom Vero cellodling analys. Myggor är sorterade efter fälla plats och arter, och grupperas i pooler innehåller ≤ 50 individer. Poolade prover homogeniseras i buffrad saltlösning med en mixer-kvarn och vattenfasen är ympas konfluenta Vero cellkulturer (Clone E6). Cellkulturer övervakas för cytopatisk effekt från dagar 3-7 efter ympning och eventuella virus odlas i cellkulturer identifieras genom lämpliga diagnostiska tester. Genom att använda denna metod, har vi isolerat 9 olika virus från myggor samlats in i Connecticut, USA, och bland dessa finns 5 kända för att orsaka sjukdomar hos människan. Tre av dessa virus (West Nile-virus, Potosi virus, och La Crosse-virus) är nya rekord för Nordamerika eller New England sedan 1999. Förmågan att upptäcka en mångfald av virus är avgörande för att övervaka både etablerade och nytillkomna virus i mygga befolkningen.
Protocol
1. Mosquito sortering och identifiering
- Följande procedurer utförs på ett öppet laboratorium bänk i en särskild biosäkerhet nivå-2 (BSL-2) laboratorium av personal som är utbildade för att arbeta med levande myggor. En "kall-chain" upprätthålls under hela förfarandet.
- Bedöva levande vuxna myggor genom att placera mygga samling väska i en -20 ° frys i 5 minuter. Överföring uppsamlingspåse till en isolerad behållare som innehåller torris. Stäng locket och utsätta myggor till koldioxid i 1-3 minuter för att säkerställa fullständig knock-down.
- Knacka på sövda myggor på en pre-kylda pan placeras på en bädd av torris. Separata enskilda honmyggorna med fin pincett och placera i plast portion koppar. Täck med lock och placera kopparna på våt is.
- Identifiera myggor arter med hjälp av beskrivande taxonomisk nycklar baserad på externa myggor morfologi med hjälp av en stereo dissekera mikroskop (10-60X zoom) monterad på en elektronisk chill bord.
- Kombinera identifierade myggarter i pooler på ≤ 50 personer i 2 ml snap-lock injektionsflaskor innehållande en koppar BB. Flaskorna är märkta med en unik identifierare.
- Efter identifiering av alla myggor, är flaskorna placeras i märkta påsar och hölls i en frigolit svalare innehåller torris.
- Förvara mygga pooler i -80 ° C frys fram testmetoder för virus.
2. Biosäkerhet överväganden att isolera virus från myggor
- Följande procedurer utförs i en biosäkerhetsnivå-3 (BSL-3) laboratorium av personal som är utbildade för att arbeta på denna nivå av inneslutning 1. Laboratorier, utrustning, rutiner och praxis är föremål för institutionella, statliga och federala översyn och kontroll. Sök lämplig utbildning och godkännande innan du försöker med följande protokoll.
- Bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) för varje förfarande som disponibel klänningar, handskar, sköldar ansikte och andningsskydd.
- Desinficera arbetsytor med 70% alkohol före och efter avslutad förfaranden.
- Cellodlingar och potentiellt infektiöst material hanteras i en klass II biosäkerhet skåp (BSC).
- Mosquito pooler är homogeniseras i en mixer-kvarn som är placerad inuti en BSC.
- Mosquito homogenat är centrifugeras i en aerosol-tight mikrocentrifug. Om detta förfarande inte kan utföras inom ett BSC bör operatören bära andningsskydd vid arbete och hämta prover från centrifugen.
- Pipetter och pipettspetsar hantering av material i BSC (biosäkerhet skåp) är indränkt i 10% blekmedel före autoklavering. Allt laboratorieavfall dekontamineras genom autoklavering före kassering.
3. Beredning av Vero celler
- Dekantera kultur media från en stor vävnadsodling kolv (175 cm 2) av konfluenta Vero celler (Clone E6) i avloppsvattnet bägare som innehåller blekmedel.
- Tvätta Vero-celler genom att lägga till en 5 ml alikvot av PBS och snurra över lager av celler och längs sidorna i kolv och se till att grundligt täcka hela monolager.
- Dekantera PBS i avfallshantering bägare.
- Tillsätt 2,5 mL Trypsin-EDTA och snurra över lager av celler och se till att grundligt täcka hela monolager.
- Inkubera kolven i kuvös i 5 minuter vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Skaka försiktigt och snurra kolven för att avlägsna celler från undersida. Cellerna bör glider lätt, inkubera ytterligare 1-5 minuter, om cellerna inte lätt glider av.
- Tillsätt 5 ml Minimal Essential Media (MEM), 5% fetalt bovint serum (FBS), med hjälp av ett serologiskt pipett och pipettera upp-och-ned 10-20 gånger för att bryta upp klumpar av celler.
- Tillsätt ytterligare 15 ml MEM, 5% FBS för en total volym på 22,5 ml och blanda väl.
- Placera 40 små flaskor vävnadsodling (25 cm 2) upprätt på två rack (20 flaskor / rack).
- Placera rack som innehåller flaskor inne i biosäkerhet skåpet och ta bort flaskan mössor, placera mössor direkt framför kolvar.
- Tillsätt 4 mL MEM, 5% FBS till varje kolv med hjälp av en serologisk pipett.
- Tillsätt 0,5 ml suspenderade celler till varje kolv (~ 01:06 delningsförhållande) Byt kolv mössor.
- Tillsätt 50 ml MEM, 5% FBS tillbaka till den ursprungliga stora vävnadsodling kolv som innehåller de resterande cellsuspension (~ 2,5 MLS) och gå tillbaka kolven till inkubatorn. Samma stora vävnadsodling kolv kan återanvändas upp till fem stycken och sedan en ny kolv bör inrättas för att ersätta den.
- Lägg små vävnadskultur flaskor i travar på facket. Snurra facket att se till att media jämnt täcker botten av flaks.
- Lägg små flaskor i inkubatorn vid 37 ° C, 5% CO 2 och växa över natten tills 80-90% konfluenta.
4. Beredning av mygga pooler
- Håll mygga pooler kallt under testförfarandet. Använd före kyldafrys rack och mixer-kvarn kassetter, iskall reagens och en kyld centrifug vid behandling av mygga pooler.
- Placera rören innehåller myggor i en pre-kyld frys rack och tillsätt 1 - 1.5 ml PBS-G för att varje rör av myggor.
- Hämta mixer-kvarn kassetter från frysen. Placera 24 rör i varje kassett och säker i mixer-kvarnen.
- Homogenisera proverna under 4 minuter vid 25 cykler / sekund. Mixern kvarnen skakar rören med hög hastighet och en metall BB inuti varje rör stör mygga vävnad.
- Centrifugrör i 6 minuter vid 7000 rpm.
- Placera rören tillbaka in i frysen ställningar tills inokuleras i Vero celler.
5. Inympning av Vero celler med myggnät pool homogenat
- Kontrollera minst en kolv vävnadskultur från varje serie i inverterat mikroskop för att säkerställa tillräcklig confluency och cell hälsa, vänta ca 80-90% täckning.
- Rada upp 20 små flaskor vävnadskultur i ett rack och kolvar etikett med motsvarande anslutning siffror från varje mygga pool.
- Lossa mössor och dekantera flesta medier från kolvarna vävnadsodling i avfall bägare. Lämna tillräckligt med material i kolven helt päls cell monolager.
- Alikvotera 100μL av supernatanten från varje bearbetat mygga pool i motsvarande vävnadsodling kolv.
- Tillbaka och dra åt locket kultur kolv.
- Lägg kultur flaskor platt på shaker i 5 minuter (rumstemperatur) på 35-40 rpm.
- Återgå 20 flaskor vävnadskultur till upprätt läge i ett ställ och plats i BSC.
- Avtäckning 3 flaskor vävnadsodling på en gång, dosera 4 mL tillväxt medier i varje kolv med hjälp av en serologisk pipett, byta mössor.
- Se till att pipettspetsen inte kontaktar nacken kultur kolv eller läpp. Byt pipettspetsar nödvändiga om kontakt sker med kolven.
- Inkubera vävnadskultur kolvar vid 37 ° C, 5% CO 2.
6. Screening Vero celler för virus tillväxt
- Screen inokulerade flaskor vävnadsodling för tecken på virusinfektion, cytopatisk effekt (CPE), från 3-7 dagar efter ympning.
- Inspektera cellkulturer för CPE och / eller förorening genom att luta kolvarna och granska media som pooler längst ner på kolven. Medierna kommer att se grumlig som de celler försämras under CPE eller på grund av tillväxt av jäst, svamp eller bakteriell kontamination.
- På nytt granska cellkulturer som uppvisar klart media under ett inverterat mikroskop. Virus kommer att få celler att bli deformerad och kommer att bryta sig loss från den kultur kolvarna. Cellkulturer med synliga föroreningar, t.ex. jäst, andra bakterier, svamp eller tung mygga skräp, är testas genom att skicka den ursprungliga mygga poolen genom en 0.22μM spruta filter.
- Aseptiskt avstå 1-2 ml av media från virus-positiv cellkulturer i märkta cryotubes med hjälp av en serologisk pipett.
- Virus kulturer lagras vid -80 ° C tills identifieras med hjälp av lämpliga diagnostiska analyser.
7. Beredning av reagenser
- MEM, 5% FBS. Lös 37,6 g pulvriserat MEM i en slutlig volym på 4 L av DD H 2 0. Fördela lösningen i 500 ml-portioner i media flaskor och autoklav. När lösningen har svalnat, tillsätt aseptiskt 26 ml värmeinaktiveras fetalt bovinserum, 5,2 ml L-glutamin, 5,2 ml anti-biotic/mycotic och 10,4 ml 7,5% bikarbonat till varje flaska. Förvaras vid 4 ° C.
- PBS-G. Lös upp 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, och 4 ml 0,5% Fenolrött till 1000 mL åååå H 2 0. Justera pH till 7,1-7,4 med 2 N NaOH (om nödvändigt). I en separat bägare, värme 600 ml H 2 0 till en koka. Ta bort från värmeplattan, tillsätt 10 g gelatin och lös upp. Lägg upplöst gelatin lösning på PBS och justera den slutliga volymen till 2 L med dd H 2 O. Tillsätt 100 ml lösning i flaskor och autoklav. När lösningen har svalnat, tillsätt aseptiskt 42,8 ml värmeinaktiveras kaninserum och 1,4 ml anti-biotic/mycotic. Förvaras vid 4 ° C.
- PBS cell tvätt. Tillsätt 50 ml 10X Dulbecco är PBS till 400 ml dd H 2 O. Justera pH till 7,1 med 2 N NaOH. Anpassa den slutliga volymen till 500 ml med dd H 2 O. Filtrera lösningen med 0.2uM vakuumfilter enhet. Fördela i 5 ml-portioner i 8 mL skruvkork rör. Förvaras vid 4 ° C.
8. Representativa resultat
Nio olika av virus från 4 taxonomiska familjer var återhämtat sig från myggor samlats under kontinuerlig Statewide övervakning i Connecticut 1997-2010 (tabell 1). Fem av dessa virus är kända för att orsaka sjukdomar hos människan, den viktigaste patogenerna är West Nile virus och östra hästencefalitvirus virus. Nya upptäckter är: den första isolering av WNV från mygg samlas upp iNordamerika under 1999 2, den första isolering av Potosi virus i nordöstra USA på 2000 3, och den första isolering av La Crosse viruset i New England i 2005 4.
| Virus | Familj | Nej isolerar | Nej platser | Nej år upptäcks | Mänskliga sjukdomar | Refs. |
| West Nile virus | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | Måttlig till svår, feber, encefalit | 2,5 |
| Östra hästencefalitvirus virus | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Svår, encefalit | 6,7 |
| Highlands J virus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Inga kända | 6 |
| Jamestown Canyon virus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Mild till måttlig, feber, hjärnhinneinflammation | 8 |
| Potosi virus | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Inga kända | 3 |
| Cache Valley virus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Mild till svår, feber, neurologiska sjukdomen i två dokumenterade fall | |
| Trivittatus virus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Inga kända | |
| La Crosse virus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Måttlig till svår, encefalit | 4 |
| Flandern virus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Inga kända |
Tabell 1. Virus upptäcks i insamlats på fältet, myggor med Vero cellodling analys. Myggor samlades in under Statewide övervakning i Connecticut 1997 till 2010.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vero-cellodling-analysen fungerar som en effektiv metod att sålla fält-in myggor för en mångfald av virus. Detta står i kontrast till molekylära metoder som specifikt riktar en eller ett fåtal virus av intresse. Dessutom har vi funnit att Vero cellkultur analysen är lika om inte mer känsliga än RT-PCR-7 och ger oss virusisolat som lagras i vår referenssamling för framtida studier. Trots detta kan cellodling system inte lämpligt i många fall. Detta tillvägagångssätt medför merkostnader och utbildning som krävs för att växa virus i en BSL-3 laboratorium, men kan dessa kostnader att uppvägas av relativt billig tillbehör för cellodling. Det är också värt att notera att de flesta men inte alla myggor virus producera CPE i Vero cellodling 9,10. Dengue är ett anmärkningsvärt undantag som bör kontrolleras av någon annan diagnostisk test. Helst är en kombination av både molekylära och cellodling metoder som används för att testa för virusinfektion. Vi arbetar för närvarande med konventionella och kvantitativ RT-PCR-analyser 4,11,12, ibland i kombination med sekvensering, för att identifiera virus som isolerats i cellkultur, och att bekräfta infektion i mygga poolen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt de viktiga bidragen från Dr. John Anderson, Andrew Main och Shirley Tirrell till denna studie. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Center for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) och US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 och CONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
