Summary
我々はプロセスに方法を記述し、画面のヴェロ細胞培養アッセイによりウイルスの多様性のための蚊をフィールド集めた。この手法を採用することにより、我々はコネチカットで収集された蚊の4分類の家族から9種類のウイルスを検出した。
Abstract
蚊は、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、およびchickungunyaウイルスとして重要なヒト病原体などの異なるウイルスの数を送信する。これらのウイルスの多くは彼らの流行の範囲で激化し、新しい地域に拡大し、これらの脅威に対応するための効果的な監視と制御プログラムを必要としている。ウイルスの活動を監視する一つの戦略は、流行のサイトから蚊が大量に収集し、ウイルス感染のためにそれらをテストして。この記事では、我々は、プロセスを処理する方法について説明し、画面のヴェロ細胞培養アッセイにより感染性ウイルスのための蚊をフィールド集めた。蚊は、トラップの位置や種によって並べ替え、および≤50人を含むプールにグループ化されます。プールされた標本は、ミキサー、ミルと水相がコンフルエントVero細胞培養（クローンE6）に接種している使用して緩衝生理食塩水でホモジナイズされています。細胞培養は、日3月7日、接種後から細胞変性効果のために監視され、細胞培養で増殖したウイルスは、適切な診断アッセイによって識別されます。このアプローチを利用することにより、我々はコネチカット、米国で収集された蚊から9種類のウイルスを分離しており、これらのうち、5はヒトの疾患を引き起こすことが知られている。これらのウイルスのうち3つは（ウエストナイルウイルス、ポトシウイルス、そしてラクロスウイルス）北米または1999年以来、ニューイングランド地方のための新しいレコードを表します。ウイルスの広い多様性を検出する能力は、蚊の人口に設立され、新たに出現したウイルスの両方を監視することが重要です。
Protocol
1。蚊のソートと同定
- 次の手順は、ライブ蚊で動作するように訓練されているスタッフが、専用のバイオセーフティレベル2（BSL - 2）実験室でのオープンラボのベンチ上で実行されます。 "コールドチェーン"は、プロシージャ全体で維持されます。
- 5分間-20℃の冷凍庫で蚊コレクションのバッグを置くことで成虫に住んで麻酔。ドライアイスを含む断熱容器に回収袋を転送します。蓋を閉じて、ノックダウンを完全に保証するために1〜3分間、二酸化炭素に蚊を公開。
- ドライアイスのベッドの上に置かれたプレ冷やした皿に麻酔蚊をタップします。細かい鉗子とプラスチック部分のコップの位置を使用して別々の個々のメスの蚊。濡れた氷の上に蓋と場所カップをカバー。
- 電子冷却テーブルに取り付けられたステレオ解剖顕微鏡（10 - 60Xズーム）の助けを借りて、外部の蚊の形態に基づいて説明的な分類学のキーを使用して、種の蚊を識別します。
- 銅のBBを含む2mLのスナップキャップバイアルの≤50人のプールに蚊種を同定組み合わせる。バイアルは、一意の識別子でラベル付けされます。
- すべての蚊の識別に続いて、バイアルは、ラベルの付いた袋に配置され、ドライアイスを含む発泡スチロールのクーラーで開催。
- ウイルス検査まで-80℃のフリーザーで蚊プールを保管してください。
2。蚊からウイルスを分離するバイオセーフティに関する注意事項
- 以下の手順は、封じ込め1のこのレベルで動作するように訓練されているスタッフによるバイオセーフティーレベル3（BSL - 3）実験室で行われる。実験室の設備、機器、手続及び慣行は、機関、州、および連邦政府の監督と検査の対象となります。次のプロトコルを試行する前に、適切な訓練と承認を求める。
- 使い捨てガウン、手袋、フェイスシールド、および呼吸器などの各手順については、適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。
- 完了手続きの前と後に70％アルコールで作業面を消毒する。
- 細胞培養と感染性物質はクラスIIバイオセーフティキャビネット（BSC）で処理されます。
- 蚊プールは、BSCの内部に配置されているミキサーミルでホモジナイズされています。
- 蚊のホモジネートは、エアロゾル、タイトなマイクロ遠心機で遠心分離されています。この手順はBSC内で実行できない場合に遠心分離機からサンプルを操作し、取得する際に、演算子は、人工呼吸器を着用してください。
- BSC（バイオセーフティキャビネット）で材料を処理するピペットとピペットチップは前にオートクレーブ〜10％の漂白剤に浸漬されています。すべての実験室の廃棄物は、廃棄前にオートクレーブして除染されている。
3。 Vero細胞の調製
- 漂白剤を含む廃棄物のビーカーにコンフルエントVero細胞（クローンE6）の一つの大きな組織培養フラスコ（175cm 2の ）からデカント培地。
- 5mLのPBS物のアリコートと細胞の層上に、徹底的に全体の単分子層をカバーすることを確認してフラスコの側面に沿って渦を追加することで、Vero細胞を洗う。
- 廃棄物のビーカーにデカントPBS。
- トリプシン- EDTAと全体の単分子層を徹底的にカバーすることを確認し、細胞の層の上に渦の2.5 mLを加え。
- 37℃で5分間インキュベーターにフラスコをインキュベート° C、5％CO 2。
- ゆっくりと底面から細胞を除去するためにフラスコを振ると渦巻き。細胞が簡単にオフにスライドするはずです。細胞が簡単に滑り落ちるいない場合は、さらに1〜5分間インキュベートする。
- 細胞の塊を分割し、上下10〜20倍血清ピペットとピペットを用いて、最小必須培地（MEM）、5％ウシ胎児血清（FBS）5 mLを追加します。
- 22.5 mLの総ボリュームに対して追加15mlのMEM、5％FBSを加え、よく混ぜる。
- 直立2台のラック（20フラスコ/ラック）40小さな組織培養フラスコ（25cm 2の ）場所。
- バイオセーフティキャビネット内部のフラスコを含むラックを置き、直接フラスコの前にキャップを置き、フラスコのキャップを取り外します。
- 血清学的ピペットを使用して、各フラスコにMEM、5％FBSを4mLを分注する。
- 各フラスコに0.5mlの細胞懸濁液を分注する（〜1時06分割比）フラスコのキャップを交換してください。
- 残りの細胞懸濁液（約2.5 MLS）を含む元の大きな組織培養フラスコに戻ってMEMを50mL、5％FBSを追加し、インキュベーターにフラスコを返します。同じ大規模な組織培養フラスコを5継代まで再利用されるかもしれないし、新しいフラスコは、それを置き換えるために、設定する必要があります。
- トレイのスタックに小さな組織培養フラスコを置きます。渦巻メディアが一様にflaksの底をカバーしていることを確認するトレイ。
- ° C、5％CO 2は、37℃インキュベーターで小さなフラスコを置き、80〜90％コンフルエントになるまで一晩成長する。
4。蚊のプールの準備
- テスト手順の間に蚊プールは冷やしておく。あらかじめ冷却に使用します冷凍庫のラックとミキサーミルカセット、氷冷試薬、および冷却遠心蚊の処理プール。
- 場所チューブはあらかじめ冷却冷凍庫のラックに蚊を含むと1を追加 - 1.5mLのPBS - Gを蚊の各チューブに。
- 冷凍庫からミキサーミルカセットを取り出す。ミキサーミルで固定し、各カセットに24チューブをセットし、。
- 25サイクル/秒で4分間、サンプルをホモジナイズする。ミキサーミルは、蚊の組織を破壊する各管の内部に高い速度と金属製のBBでチューブを交わしている。
- 7,000 rpmで6分間チューブを遠心する。
- Vero細胞に接種するまでバックフリーザーラックにチューブを置きます。
5。蚊プールホモジネートによるVero細胞の接種
- 十分なコンフルエンシーと細胞の健康を確保するために、倒立顕微鏡下でそれぞれのシリーズから少なくとも一つの組織培養フラスコをチェックして、80〜90％範囲については期待しています。
- ラインアップ各蚊プールから対応するアクセッション番号とラックとラベルのフラスコに20の小さな組織培養フラスコを。
- キャップを緩めて、廃棄物のビーカーに組織培養フラスコからのメディアのほとんどをデカントする。完全にコートの細胞単層にフラスコ内に十分なメディアにしておきます。
- 対応する組織培養フラスコに各処理蚊のプールからの上清のアリコート100μL。
- 培養フラスコのキャップを取り付けて締めます。
- 35〜40 rpmで5分間（室温）のためにシェーカーで培養フラスコを寝かせて。
- BSCのラックと場所で直立位置に20組織培養フラスコを返します。
- 一度で3組織培養フラスコをUncapping、血清学的ピペットを使用して、各フラスコに4 mLの増殖培地を分注し、キャップを交換してください。
- ピペットチップは、培養フラスコの首や唇に接触しないようにしてください。接触がフラスコで作られている場合は、必要に応じてピペットチップを変更してください。
- 37組織培養フラスコをインキュベート° C、5％CO 2を 。
6。ウイルス増殖のためのVero細胞をスクリーニング
- 画面には3-7日後に接種から、ウイルス感染の兆候、細胞変性効果（CPE）のために組織培養フラスコに接種した。
- 視覚的傾斜によるCPEおよび/または汚染のための細胞培養フラスコを検査し、フラスコの下部にあるプールというメディアを検討。細胞がCPEの間に劣化や酵母、真菌、または細菌汚染の成長に起因するとして、メディアが濁って表示されます。
- 倒立顕微鏡下で曇りのメディアを示す細胞培養を再検討する。ウイルスは細胞が変形したり、培養フラスコから緩んで壊れてしまう原因になります。目に見える汚染物質による細胞培養、例えば、酵母、他の細菌、真菌や重い蚊の破片は、0.22μMシリンジフィルターを通してオリジナルの蚊のプールを渡すことによって、再テストされています。
- 無菌的に血清用ピペットを用いて標識クリオチューブにウイルス陽性細胞の培養物からのメディアの1〜2 MLSを分注する。
- 適切な診断アッセイを用いて同定されるまで、ウイルスの培養液を-80℃で保存されています。
7。試薬の調製
- MEM、5％FBS。 DD H 2 0の4リットルの最終容量に粉末MEMの37.6 gを溶かす。メディアボトルとオートクレーブで500 mLのアリコートにソリューションを分注する。溶液を冷却しているときは、無菌的に各ボトルに26mlの熱不活化ウシ胎児血清、5.2 mLのL -グルタミン、5.2 mLのanti-biotic/mycotic、と10.4 mLの7.5％重炭酸ナトリウムを加える。 4℃で保存します。
- PBS - G。 16グラムのNaCl、0.4グラムのKCl、2.3グラムのNa 2 HPO 4、0.4グラムのKH 2 PO 4、および0.5％フェノールレッドの4 mLの1000mLのDD H 2 Oに溶解する。 2NのNaOH（必要に応じて）で7.1から7.4へのpHを調整する。別のビーカーに、沸騰のH 2 Oの熱600mLの。ホットプレートから削除、10グラムゼラチンを追加し、溶解する。 PBS溶液に溶解してゼラチン溶液を追加し、dd H 2 Oで2リットルに最終的な音量を調節ボトルとオートクレーブ中に溶液100 mLを分注する。溶液を冷却しているときは、無菌的に42.8 mLの熱不活化ウサギの血清および1.4 mLのanti-biotic/mycoticを追加します。 4℃で保存します。
- PBSの細胞の洗浄。 400mLのDD H 2 Oに50 mLの10XダルベッコのPBSを追加2 N NaOHで7.1にpHを調整する。 DD H 2 Oで500 mlに最終的な音量を調節する0.2uM真空フィルタユニットとフィルターソリューション。 8 mLのスクリューキャップチューブに5mLのアリコートに分注する。 4℃で保存します。
8。代表的な結果
4分類の家族からのウイルスの9種類は、1997年から2010年（表1）からコネチカット州の連続的な州全体の監視中に収集された蚊から回収された。これらのウイルスのうち5つは、ヒトの疾患、西ナイルウイルスと東部ウマ脳炎ウイルスであることの最も重要な病原体を引き起こすことが知られている。新たな発見が含まれます：で収集された蚊からのWNVの最初の単離を1999 2北米、2005年4 2000 3における米国北東部のポトシウイルスの最初の単離、及びニューイングランドのラクロスウイルスの最初の単離。
| ウイルス | ファミリー | 号の分離株 | 番号の場所 | いいえの年は、検出された | ヒトの疾患 | 文献。 |
| ウエストナイルウイルス | フラビウイルス科 | 1002 | 94 | 12 | 激しい、発熱、脳炎に中等度の | 2,5 |
| 東部ウマ脳炎ウイルス | トガウイルス科 | 292 | 41 | 10 | 深刻な、脳炎 | 6,7 |
| 高地Jウイルス | トガウイルス科 | 178 | 39 | 11 | 知られていない | 6 |
| ジェームズタウンキャニオンウイルス | ブニヤウイルス科 | 305 | 74 | 14 | 軽度から中等度、発熱、髄膜炎 | 8 |
| ポトシウイルス | ブニヤウイルス科 | 259 | 76 | 4 | 知られていない | 3 |
| キャッシュバレーウイルス | ブニヤウイルス科 | 114 | 51 | 8 | two文書化された場合には深刻な、発熱、神経の病気への軽度の | |
| Trivittatusウイルス | ブニヤウイルス科 | 83 | 21 | 11 | 知られていない | |
| ラクロスウイルス | ブニヤウイルス科 | 1 | 1 | 1 | 深刻な、脳炎に中等度の | 4 |
| フランダースウイルス | ラブド | 4 | 4 | 2 | 知られていない |
表1。ウイルスは、ベロ細胞培養アッセイにより、フィールド収集した蚊に検出された。蚊は、1997年から2010年からコネチカット州の州全体の監視中に収集された。
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Discussion
ベロ細胞培養アッセイは、ウイルスの多様性のためのスクリーンのフィールドに収集蚊に効果的な方法として機能します。これは、特にいずれか興味のあるいくつかのウイルスを標的分子の方法とは対照的です。また、我々は、ヴェロ細胞培養アッセイが均等にRT - PCR 7より多くの敏感な場合ではないと今後の研究のために私達の参照のコレクションに格納されているウイルス分離株を提供してくれることを発見した。それにもかかわらず、細胞培養システムは、多くの場合適切ではない場合があります。このアプローチは、BSL - 3実験室でウイルスを成長させるために必要な追加の費用や研修が生じますが、これらの費用は、細胞培養のための比較的安価な供給によって相殺される可能性がある。また、ほとんどすべてではない蚊が媒介するウイルスがベロ細胞培養9,10でCPEを作り出すことは注目に値します。デング熱ウイルスは、別の診断テストでスクリーニングされるべき注目すべき例外である。理想的には、両方の分子および細胞培養方法の組み合わせは、ウイルス感染のためにテストするために使用されています。我々は現在、細胞培養で分離されたウイルスを識別するために、そして蚊プールで感染を再確認するために、シーケンスと一緒に時々 、従来と定量的RT - PCRアッセイ4,11,12を使用しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は感謝して博士の重要な貢献を認識する。ジョンアンダーソン、アンドリューメインと本研究へのシャーリーティレル。この作業は、疾病管理予防（U50/CCU116806-01-1）と米国農務省（58-6615-1-218、CONH00768、およびCONH00773）センターからの補助金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
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