Summary

Detecção de vírus infecciosos de Campo mosquitos coletados por Vero Ensaio Cultura de Células

Published: June 09, 2011
doi:

Summary

Nós descrevemos um método para processar e tela de campo coletados mosquitos para uma diversidade de vírus por cultura de células Vero ensaio. Empregando esta técnica, temos detectados nove tipos diferentes de vírus provenientes de 4 famílias taxonômicas em mosquitos coletados em Connecticut.

Abstract

Os mosquitos transmitem uma série de vírus diferentes, incluindo importantes patógenos humanos, tais como vírus do Nilo Ocidental, o vírus da dengue eo vírus chickungunya. Muitos desses vírus se intensificaram nas suas gamas endêmicas e se expandiu para novos territórios, necessitando de programas eficazes de vigilância e controle para responder a essas ameaças. Uma estratégia para monitorar a atividade do vírus envolve a coleta de um grande número de mosquitos dos locais endêmicos e testá-las para a infecção viral. Neste artigo, descrevemos como lidar, processo e tela de campo coletados mosquitos de vírus infecciosos de células Vero por ensaio de cultura. Os mosquitos são classificadas por localização armadilha e espécies, e agrupados em pools contendo ≤ 50 indivíduos. Espécimes agrupados são homogeneizados em salina tamponada com um misturador-mill ea fase aquosa é inoculada em culturas de células Vero confluentes (Clone E6). Culturas de células são monitorados para efeito citopático do dia 07/03 pós-inoculação e qualquer vírus cresceu em cultura de células são identificadas pelos testes de diagnóstico apropriado. Ao utilizar esta abordagem, temos isolados 9 tipos diferentes de vírus a partir de mosquitos coletados em Connecticut, EUA, e entre estes, cinco são conhecidos por causar doenças no homem. Três destes vírus (vírus do Nilo Ocidental, vírus Potosi e La Crosse vírus) representam novos registros para a América do Norte ou da região da Nova Inglaterra desde 1999. A capacidade de detectar uma grande diversidade de vírus é fundamental para monitoramento ambos estabelecidos e vírus emergentes na população de mosquitos.

Protocol

1. Triagem e identificação de mosquitos Os seguintes procedimentos são realizados em uma bancada de laboratório aberto em uma dedicada biossegurança de nível 2 (BSL-2) por pessoal de laboratório que são treinados para trabalhar com os mosquitos vivos. A "cadeia de frio" é mantida durante todo o procedimento. Anestesiar os mosquitos adultos vivem colocando bolsa coletora de mosquito em um freezer -20 ° por 5 minutos. Saco de transferência de coleção para um recipiente isolado c…

Discussion

Vero ensaio de cultura celular serve como um método eficaz para mosquitos tela de campo recolhidas para uma diversidade de vírus. Isto contrasta com os métodos moleculares que atingem especificamente a um ou alguns vírus de interesse. Além disso, descobrimos que ensaio de cultura de células Vero é tão ou mais sensível do que a RT-PCR 7 e fornece-nos isolados do vírus que são armazenados em nossa coleção de referência para estudos futuros. No entanto, os sistemas de cultura de células pode não …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos as importantes contribuições dos drs. John Anderson, Andrew principal e Shirley Tirrell a este estudo. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e do Departamento de Agricultura dos EUA (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).

Materials

Name of reagent/ equipment Company Catalog Number
Fetal bovine serum Gibco – Invitrogen 16140
Anti-biotic/mycotic Gibco – Invitrogen 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. Gibco – Invitrogen 25080
L-Glutamine 200mM 100x Gibco-Invitrogen 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) Gibco – Invitrogen 11700
10X Dulbecco’s PBS Gibco – Invitrogen 14080
Trypsin-EDTA Gibco – Invitrogen 15400
Rabbit serum Gibco – Invitrogen 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon – Becton Dickinson 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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Cite This Article
Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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