Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Высокая пропускная способность На месте Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта

doi: 10.3791/2912 Published: August 19, 2011

Summary

Здесь мы описываем эффективные высокой пропускной способности

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Синтез дигоксигенин-11-UTP-Маркированный Riboprobe от ПЦР, созданных с использованием шаблона

  1. Для синтеза генов конкретного riboprobe, используйте Entrez Джин (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), чтобы получить ген кДНК ссылка (RefSeq). Используйте Primer3 программы (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 проектировать ген-специфической ПЦР праймеры против 3'-области кДНК последовательности. Рекомендуемые параметры для выбора праймеров ПЦР описаны в другом месте (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
  2. Используйте MegaBLAST программы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 оценить специфику выбранной последовательности ДНК. Последовательность ДНК считается конкретное, когда, используя ОЖИДАТЬ порог 0,01, она не совпадает с другой последовательности в базе данных RefSeq.
  3. ПЦР усиливают riboprobe шаблона. ПЦР-реакции компонентов и термоциклирования условия должны быть оптимизированы для каждого праймера множество. Типичный 50 мкл реакции содержит: 1X буфере, 2 мМ MgCl 2, 0,2 мм дНТФ, 1X Q решение, 1 мкг кДНК, 2.5U ДНК-полимеразы Taq, 0.25μm грунтовки, и нуклеазы без H 2 O. Типичный протокол термоциклирования включает в себя начальный денатурации при 94 ° С в течение 2 мин затем 40 циклов 94 ° С в течение 30 сек, 57 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 1 мин и окончательного расширения при 72 ° С в течение 10 минут. КДНК использовали в реакции ПЦР синтезируется из мыши мочеполовой мРНК.
  4. Отдельный продукт ПЦР методом электрофореза в агарозном геле, очищают с помощью набора Гель Добыча, и количественно очищенные продукты спектрофотометрии. Ожидаемая доходность составляет 1,2 - 3.6μg.
  5. Расшифруйте ПЦР продукта в меченых riboprobe. Транскрипции реакции (40 мкл) содержит: 400ng очищенный продукт ПЦР, 1X нуклеотидные смеси маркировки содержащих дигоксигенин 11-UTP, 1X транскрипции буфера, 5U РНКазы ингибитора 80У Т7 РНК-полимеразы, и нуклеазы без H 2 O. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° С и агитировать образцы каждые 30 минут.
  6. Используйте Qiagen RNEASY Мини набор для очистки riboprobes на основе инструкции по очистке РНК с по-колонки пищеварения ДНКазы. Riboprobes количественно спектрофотометрически. Ожидаемая доходность 4-20 мкг. Оценка качества зонд, разделяя аликвоты с помощью электрофореза на 1,5%, без денатурирующих агарозном геле. Высокое качество зондов мигрируют в качестве отдельных полос с минимальными смазыванию.
  7. Для обеспечения riboprobe в частности, признается своей цели, включают положительную ткани управления для первых ISH эксперимента. Целевой мРНК riboprobe это изображение должно быть известно в этом позитивном ткани контроля.

2. Подготовка вибрационный Клинок Микротом (на основе ранее описанного протокола) 7

  1. Подготовка 4% легкоплавкой агарозы решение в фосфатным буферным раствором (PBS). Микроволновая решение о роспуске агарозы и поддерживать решения на 62 ° C.
  2. Подготовка форм полистирола кольца путем удаления мембраны из пластин диаметром 12 мм культуры Millicell также вставки и сохранить полистирола кольцо для использования в качестве формы агарозы. Замочите кольца на ночь в раствор ингибитора РНКазы перед каждым использованием.
  3. Чтобы обеспечить гладкую поверхность резки, удаления ржавчины ингибитора и другие добавки с поверхности лезвия Wilkinson промыванием следующих растворителей, при 100%-ной концентрации: петролейный эфир, ксилола, хлороформа, метанола и MilliQ воды. Отдельные двойным лезвием вдоль на две отдельные лопасти.
  4. Придерживайтесь Уилкинсон лезвия микротома лезвие с Loctite клей. Микротома лезвие не используется для резки; он добавляет жесткость лезвия Wilkinson. Микротома лезвия должны быть сокращены к длине лезвия Wilkinson с использованием металлических ножниц и, как только придерживался, должны быть компенсированы 3 - 4 мм от передний край лопасти Уилкинсон.

3. Вскрытие, хранение и подготовка Урогенитальные Ткани для Секционирование

  1. Подготовка PBSTw раствор (PBS, содержащего 0,1% Твин ™ 20 и 0,2 мм азид натрия, фильтруют через 0.22μm Stericup ® фильтр). Решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C.
  2. Инкубируйте недавно расчлененный мыши LUT (мочевой пузырь, мочеиспускательный канал тазовых и связанные с ними Вольфианская и Mϋllerian протока-производных структур) в течение ночи при температуре 4 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида фиксатором.
  3. Дегидрировать тканей промывкой в ​​течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (1:3, 1:1, 3:1 об / об) решений. Магазин образцы при -20 ° С на 100% метанола по крайней мере за одну ночь. Архив ткани могут быть по крайней мере 2yr.
  4. Подготовка тканей для секционирования по станавливающим архив тканей. Промыть в течение 10 минут при 25 ° С в серии градуированных метанол / PBSTw (3:1, 1:1, 1:3 об / об) решений.
  5. Препарировать и отказаться примерно две трети из мочевого пузыря, в результате чего большинство из треугольника части и крепятся к уретре.
<р = класс "jove_title"> 4. Вложение Урогенитальные тканей в агарозном

  1. Место плесень полистирола кольца, плоские поверхности вниз на 25 ° C ясно микроскопический слайд стекла.
  2. Заполните форму кольца с 62 ° C агарозном решения и остыть в течение 2 мин.
  3. Удалить LUT ткани PBSTw и насухо промокните на абсорбирующей салфеткой.
  4. Передача ткани в раствор агарозы.
  5. Используйте пинцет, чтобы ориентировать LUT ткани в агарозном так, чтобы она подвешена на полпути между верхней и нижней частях кольца плесени и инкубировать ткани при температуре 4 ° С до агарозном укрепил.
  6. Если ткань раковины полностью в процессе затвердевания агарозы, он может быть исключен из агарозы и повторно внедрены. Отрегулируйте время охлаждения агарозы по мере необходимости во время повторного вложения процесса.

5. Секционирование Урогенитальные ткани с вибрационный Микротом (на основе ранее описанного протокола) 7

  1. Горы усиленные лезвия Wilkinson в вибрирующих микротома и установить лезвие угол до 35 °. Заполните ванну люкс образца с PBS и упаковать мокрого льда вокруг образца ванну.
  2. Удаление затвердевшей агарозы вилку из кольца плесень и пятна с поверхности дна абсорбирующие салфетки. Убедитесь, что ткань ориентирована правильно. Ткани ориентации могут быть скорректированы с помощью лезвия бритвы, чтобы скос плоского края плагин агарозы.
  3. Придерживайтесь плагин агарозы на вибрирующих микротома образца установки диска с Loctite клей, как показано на рис. 1А.
  4. Вставьте образец установки диска в vibratome.
  5. Отрегулируйте микротома толщиной 50 мкм раздел, скорость до 2, а амплитуда лезвия до 4 и начните вырезать срезах тканей.
  6. Используйте тупой пинцет для передачи каждой ткани сечения (рис. 1В) до 24-и культуре пластины хорошо, что содержит ледяной 0,5 мл PBSTw.
  7. Для подготовки образцов для гибридизации на месте, акцизов большинство из агарозы вокруг каждого срез ткани (остальные агарозном будет таять во время процедуры ISH) и удалить все связанные с мусором. Магазин сечением до 48 ч при 4 ° С в PBSTw.

6. Пример корзины Подготовка к В гибридизация

  1. Отрежьте нижнюю часть микроцентрифужных трубки на 100 мкл марки.
  2. Тепло сократить край трубки в пламени, пока пластик размягчается, а затем нажмите микроцентрифужных трубки твердо на центр 0,5 дюйма квадратными ячейками полиэстера.
  3. Обрезать избыток сеткой и использовать подогревом 18 иглу, чтобы проколоть два отверстия в каждую пробирку крышкой для завершения подготовки корзине (рис. 1в).
  4. Снимите крышку 24 лунками и сверлить отверстия 12 мм с центром над каждую лунку. Используйте крышку для передачи образцов корзины между моет протокола ISH (рис. 1D).

7. Эмбрион Порошок Подготовка к В гибридизация (на основе ранее описанного протокола) 8

  1. Сбор ткани эмбриона мыши от мышей, которые являются одной сцене как срезах тканей, которые оцениваются и хранить при температуре -80 ° C. Место замороженной ткани в керамический строительный раствор, погрузите ткани в жидком азоте, а также использовать пестик для измельчения ткани в мелкий порошок.
  2. Комбинат эмбриона порошок с 4-х томах ацетона и гомогенизации с несколькими ударами гомогенизатор Dounce.
  3. Передача гомогената на 15 мл стеклянный завинчивающейся флакон и извлекать на ночь при 4 ° C.
  4. Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют содержащих липиды супернатант. Ресуспендируют ткани пеллет в 4vol свежего ацетона и экстракт для 2ч при температуре 4 ° C.
  5. Гранул эмбриона порошка путем центрифугирования при 5000rpm в течение 10 минут при 4 ° C. Удаляют супернатант.
  6. Воздух сухой осадок на # 2 Whatman фильтровальной бумаги. Давка гранул для получения мелкого порошка и хранить в плотно закрытых стеклянных флакона при 4 ° C. Приблизительную мощность составляет 50 мг порошка на 1 г сырого веса эмбриона.

8. Ситу В День Гибридизация 1

  1. Разогреть prehybridization решение (50% формамида, 5x SSC, 1% Блокировка реагента, 10μg/mL дрожжевой тРНК, гепарин 10μg/mL хранить при -20 ° C) до 60,5 ° C. Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре -20 ° C.
  2. Подготовка влажной камере гибридизации, заполнив небольшую пластиковый контейнер хранения с примерно 0,5 в водопроводной воде. Крышка контейнера и подогреть до 60,5 ° C.
  3. Добавить 2 мл PBSTw для скважин из 24-и культуру пластину. Место образец корзины в отверстия 24-а крышку пластины и секции передачи ткани в корзинах (до 10 секций в корзине были использованы).
  4. Инкубируйте срезов ткани в течение 30 минут при 25 ° С в 6% H 2 O 2. Этот и все последующие инкубации должно осуществляться с нежным агитации на орбитальный шейкер, если не указано иное. Все инкубацииг моет проводятся в 24-луночных планшетах и ​​использование общего объема решение 2mL/well.
  5. Вымойте срезах тканей 4 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
  6. Инкубируйте срезах тканей для 12 мин при 25 ° С в PBSTw содержащие 5μg/mL протеиназы К.
  7. Вымойте срезах тканей 1 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
  8. После исправления срезах тканей для 20 минут при 25 ° С в PBS, содержащий 4% параформальдегида и 0,2% глутарового альдегида.
  9. Вымойте срезов ткани 2 х 5 мин при 25 ° С в PBSTw.
  10. Добавить 2mL/well из нагретого буфера prehybridization и инкубировать срезах тканей внутри влажной камере гибридизации, по крайней мере 1 час при 60,5 ° C.
  11. Добавить 0.65μg помечены riboprobe к prehybridization буфера в каждую лунку и инкубировать срезов ткани на ночь в увлажненной камере гибридизации на 60,5 ° C.

9. Ситу В День Гибридизация 2

  1. Подготовьте следующие решения для пост-гибридизации шаги моющие: Решение 1 (50% формамида, 5x SSC, 1% SDS), Решение 2 (10 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,5 М NaCl, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия , 0.22μm фильтруется), и решение 3 (2x SSC, 50% формамид). Эти решения могут быть подготовлены заранее. Решения 1 и 3 хранятся при температуре -20 ° С и Решение 2 хранится при температуре 25 ° C. Срок хранения решения составляет не менее 3 месяцев.
  2. Вымойте срезах тканей 3 х 30 минут на 60,5 ° С, подогретого Решение 1. Использование влажной камере во время мытья.
  3. Вымойте срезах тканей 1 X 10мин на 60,5 ° С, подогретого Решение 1/Solution 2 (1:1 об / об) решение. Использование влажной камере во время стирки.
  4. Вымойте срезах тканей 4 х 10 мин при 25 ° С, Решение 2.
  5. Инкубируйте тканей разделы для 15 мин при 37 ° С в растворе 2, содержащих 0.25μg/mL РНКазы.
  6. Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 2 (без РНКазы).
  7. Вымойте срезах тканей 1 X 10 мин при 25 ° С с раствором 3, затем 2 X1hr моет на 60,5 ° С, Решение 3. Использование влажной камере при 60,5 ° C моет.
  8. Подготовьте следующие решения для иммуногистохимического выявления DIG-меченых riboprobes: ткани блокирующего буфера (туберкулез, 1X TBS, 10% овец сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0.22μm фильтруется), Антитела Разбавление Буфер (AD, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1% блокирующий реагент, 1% БСА, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0,22 м ™ фильтруется) Антитела Поглощение буфера (AA, 1xTBS, 5% овечьей сыворотки, 1 % блокирующий реагент, 1% BSA, 6mg/mL порошок эмбриона) и TBSTw (1xTBS, 0,1% Твин ™ 20, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Эти решения могут быть подготовлены заранее. TBSTw хранится при температуре 25 ° C, то все другие решения, хранятся при температуре -20 ° C.
  9. Вымойте 3 х 10 мин при 25 ° С TBSTw.
  10. Инкубируйте срезах тканей крайней мере 2ч при 25 ° С в борьбе с туберкулезом буфера.
  11. Хотя тканей вынашиваются в ТБ буфера, добавить 1.1μL анти-DIG антител в буфере 200 мкл AA для каждой скважины. Инкубируйте А. А. буфера + антитела не менее 2ч при температуре 4 ° С, то центрифуге при 10 000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант А. А. буфера и добавить его в 2 мл AD буфера.
  12. Удалить срезов ткани от туберкулеза буфера и инкубировать их в течение ночи в увлажненной камере при температуре 4 ° С в AD буфер, содержащий антитела.

10. В Ситу День Гибридизация 3

  1. Подготовка цвета решение для разработки NTMT (100 мм Трис-HCL рН 9,5, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl 2, 0,2 мм азид натрия, 0.22μm фильтруется). Это решение может быть подготовлен заранее и хранить при температуре 25 ° C. Непосредственно перед применением, добавьте 2 мМ левамизол и 0,1% Твин ™ 20.
  2. Удалить раствор антител (AD буфера + антитела) из скважин и хранить раствор при 4 ° C. Он может быть использован повторно до еще два раза.
  3. Вымойте тканей 8 х 10 мин при 25 ° С TBSTw содержащей 2 мМ левамизол.
  4. Тщательно передачи ткани от корзины чашке Петри содержащие TBSTw. Используйте пинцет, чтобы удалить видимые мусора. Передача тканей в чистые трубы микроцентрифужных.
  5. Вымойте тканей 1 X 10 мин при 25 ° С NTMT 1 мл.
  6. Удалить NTMT и добавить 1mL/tube смеси, содержащей 50% NTMT (содержащий 2 мМ левамизол) и 50% BM Purple, трубы в месте, защищенном от света окна и инкубировать при температуре 25 ° C. Цвет времени развития колеблется от нескольких часов до нескольких дней. Если цвет развивается медленно, 100% BM Фиолетовый могут быть использованы.
  7. Монитор развития и изменения цвета NTMT / BM Фиолетовый решение, если он накапливается осажденные кристаллы или если она подвергается изменению цвета с желтого до фиолетового. После полного развития цвета (4-250 часов), стирать ткани 2 х 5 мин при 25 ° С с 1mL/tube из NTMT содержащей 2 мМ левамизол.
  8. Инкубируйте тканей течение ночи при 4 ° С в 1mL/tube ФСБ, содержащий 4% параформальдегида пост-фиксатором.
  9. Для отбеливания тканей, тканей инкубировать в течение 30 минут при 25 ° С в 1mL/tube из PBSTw, содержащий 3% H 2 O 2
  10. Ткань разделы монтируются на стеклах, coverslipped, а полученную с использованием сложного микроскопа.

11. Представитель Результаты:

Пространственной ориентации LUT ткани в агарозном определяет плоскость срезах тканей. Для сагиттальной разделов, по крайней мере две трети пузырь вырезали, а оставшиеся LUT ткани вложен в агар, что уретры средней линии параллельно плоской поверхности плагин агарозы (рис. 1А). Незначительные изменения в тканях плоскости могут быть сделаны фаски плоских края плагин агарозы. Представитель сагиттальной участке от 17.5dpc мужской ткани LUT, которая ориентирована в этой плоскости показано на рисунке 1b.

Пример корзины защитить тонкие тканевые срезы от потери и от накопления пыли и твердых частиц во время многодневных ISH процедуры. Пример корзины готовятся плавления полиэфирной сетки, чтобы обрезанный конец трубки микроцентрифужную 1,5 мл (рис. 1в). Маленькое отверстие прокалывается в крышку каждого образца корзине облегчить решение поток в страну и из корзины. Пример корзины взвешены в ISH решения, помещая их в просверленные отверстия 12 мм в 24-луночный планшет крышкой (рис. 1D). Изменение крышки пластины поддержки корзины, когда они передаются между 24-луночных планшетах в течение раствора изменяется.

Задача сложная, ограничить неспецифические фоне окрашивание в течение длительного периода инкубации, необходимые для обнаружения низких мРНК изобилие. Добавлением 0,2 азид натрия в образце буферов и их последующей фильтрации через 0.22μm фильтры появились ограничить фоне окрашивания (рис. 2). Использование метода, описанного здесь, там, кажется, не видны различия в окраске фона, когда образцы инкубируют в цвете разработки решений для длительных периодов времени (рис. 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Подготовка мыши ниже мочеполовой (LUT) тракта срез ткани и микроцентрифужных трубки корзина для ISH. LUT содержащее часть мочевого пузыря, уретры и тазового связанные Вольфианская и Mϋllerian протока полученные структуры) вложена в цилиндрический разъем на 4% легкоплавкой агарозы. (А) вилка приклеены к образца установки диска и (Б) разрезать на 50 мкм секций с вибрирующим микротоме. (C) LUT разделе переносится в корзину микроцентрифужных трубка, которая готовит пирсинг отверстие в крышке трубы и сетка слияния полиэстера до конца вырезать нижнюю часть трубки. (D) микроцентрифужных трубка вставляется в 12 мм отверстия, просверленные в 24-луночный планшет крышкой, так что срезах тканей взвешены в буферный раствор в течение ISH протокола. Стрелки указывают LUT ткани в пробке агарозы.

Рисунок 2
Рисунок 2. Включение 0,2 азид натрия в 0.22μm фильтруется решения улучшает качество тканей и уменьшает фоновый окрашивания. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Ткань Срезы окрашивали по ISH с помощью зонда направлена ​​против поворот гомолога 1. Буферов, используемых для ISH были либо (А) 0.22μm фильтруется и дополнена 0,2 азид натрия (NaAz) или (В) не фильтруются и не дополнены NaAz. Стрелки указывают на фоне пятен. Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фон интенсивности окрашивания, кажется, не увеличивается с длительным развитием цвета. 17.5dpc самца мыши нижних мочеполовых путей (LUT) были секционного в сагиттальной плоскости с толщиной 50 мкм. Срезы окрашивали ISH путем инкубации их в растворе для окрашивания хромоген () 9.5h с помощью зонда, который признает высокую стенограмму изобилие эстрогена связанных гамма рецептор (Esrrg), (B) для 43.5h с помощью зонда, который признает среду изобилия Стенограмма bromodomain прилегающих к цинка домена пальцем, 2А (Baz2a), или (С) в течение 236h с помощью зонда, который признает низкой численности стенограмму бескрылые типа MMTV интеграции сайт семьи, член 10а (Wnt10a). Изображения были захвачены в то же увеличением. Результаты представитель окрашивания образцов для п = 3 помета независимые мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Использование метода, описанного здесь, можно обнаружить мРНК во всех основных типов клеток и тканей отсеков плода мужского и женского мыши ТМП в том числе мезенхимальных колодки, уротелия, гладких мышц, предстательной железы почки, семяизвергательного канала и влагалища. 50 мкм разделы, используемые в настоящем протоколе имеют то преимущество, что достаточно толстой, чтобы решать ткани архитектуры (таких как кровеносные сосуды), но достаточно тонкие, чтобы избежать захвата зонда, который является методологическая проблема часто встречается в течение всего монтажа ISH. Каждый новый riboprobe оценивается на положительные ткани управления, где окрашивание был оценен в ранее опубликованные исследования. Мы гарантируем, что окрашивание модели являются специфическими в этих тканях. Еще одно преимущество нашего метода является то, что модели несколько мРНК может быть оценен в смежных разделах ткани из той же ткани LUT. Кроме того, этот метод может использоваться в сочетании с иммуногистохимических методов визуализации ячейки специфических маркеров белков и определить типы клеток окрашивали ISH протокола. Этот метод несовместим с традиционными методами counterstaining, таких, как ядерная counterstaining с быстрой Красный или гематоксилином. Тем не менее, мы успешно контрастно образцов с люминесцентными ядерной пятен, в том числе 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI) и пропидий йодида.

Метод, описанный здесь, включает в себя несколько улучшений по сравнению с тот, который был описан ранее 7. Почти все из буферов и растворов реагентов складе в текущем рукописи готовятся заранее и могут храниться в течение длительных периодов времени, что повышает эффективность работы. Добавлением азида натрия 0,2 мм для большинства реагентов и их фильтрации через 0.22μm мембран значительно снижает неспецифическую фоне окрашивания, увеличивает реагента срок годности, и сводит к минимуму накопление твердых частиц на срезах тканей во время ISH процедуры. Эта рукопись также описывает производства проницаемой микроцентрифужных трубки корзин, которые содержат срезах тканей во время ISH и изменение нескольких хорошо культуры пластину, которая держит крышку корзины в буфер изменения. Мы обнаружили, что эти устройства, которые легко производится в лаборатории, уменьшить потери образца, свести к минимуму повреждения тканей раздел в процессе обработки, а также повысить эффективность работы. Кроме того, использование закрывающемся пластиковом контейнере камере влажности помогает защитить от испарения. Это особенно важно для срезов ткани в периферических скважин образца, где так называемый "эффект края" можно ввести экспериментальной переменной. При использовании влажности камеры, мы не наблюдали заметного окрашивания качественных различий в периферийных по сравнению с внутренним скважин образца.

Хотя этот протокол является эффективным механизмом для изучения моделей экспрессии в тканях мышей LUT, Есть некоторые ограничения, с этим методом. Эффективность обнаружения мРНК варьируется в зависимости от riboprobes и абсолютное изобилие мРНК не может быть определена. Другим ограничением является то, что окрашивание модели может варьироваться в зависимости от плоскости сечения. Чтобы свести к минимуму эти ограничения, мы оцениваем каждый мРНК картина в несколько разделов из нескольких помет-независимого плодов.

Этот метод может быть оптимизирован для визуализации моделей экспрессии мРНК в других типах тканей мыши или других видов. Такое изменение необходимо, чтобы амплитуда микротома лезвие и скорость быть оптимизированы в ткани срезов и что концентрации протеиназы К быть оптимизированы в ISH процедуры. Кроме того, необходимо предварительно поглощать анти-дигоксигенин антитела с эмбрионом порошок от одного вида ткани, которая в настоящее время оценивается на ISH. Хотя этот метод не используется для срезов ткани тоньше, чем 40 мкм, так как разделы распадаются в течение ISH окрашивания, он может быть адаптирован для использования в высокопроизводительных целом монтажа ISH окрашивания. Мы использовали этот метод для проведения целого монтажа ISH плода и новорожденных мышей простаты, а также плода гонад и почек. Для целого монтажа окрашивания ISH, необходимо оптимизировать протеиназы К ткани пищеварения, а также количество и продолжительность моет следующие ночной инкубации антитела к снижению фонового окрашивания, вызванного захватом зонд.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Lan Йи, Института рака в Нью-Джерси, для оказания технической помощи в подготовке ткани корзины. Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья и гранты DK083425 DK070219.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments Roche Group 11214667001
Blocking reagent Roche Group 11096176001
BM Purple AP substrate, precipitating Roche Group 11442074001
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100
Cell culture plate, 24 well Corning 3524
Digoxigenin 11-UTP Roche Group 1277073910
dNTPs Roche Group 11969064001
Double-edged razor blade Wilkinson Sword Classic Model
Eliminase RNase remover Decon Laboratories 1102
Formamide Sigma-Aldrich F5786-1L
Gel extraction kit Qiagen 28704
Glutaraldehyde, 25% solution in H2O Sigma-Aldrich G6257-100ML
Heparin, sodium salt Sigma-Aldrich H3393
Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O Fisher Scientific BP2633-500
Levamisole Sigma-Aldrich L9756
Loctite 404 quick set instant adhesive Henkel Corp 46551
Magnesium chloride Fisher Scientific M33-500
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375-500G
Microcentrifuge tubes, 1.5mL Biologix Research Company BP337-100
Millicell culture plate insert EMD Millipore PICM01250
Molecular grinding resin G-Biosciences 786-138PR
Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline Affymetrix 19943
Phosphate buffered saline, without Ca & Mg MP Biomedicals ICN1760420
Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" Small Parts, Inc. CMY-0033-D
Proteinase K solution, 20mg/ml Amresco E195-5ML
QIAshredder Columns Qiagen 79654
Q solution Qiagen Provided with Taq DNA polymerase
RNase Sigma-Aldrich R6513
RNase inhibitor Roche Group 03335399001
RNeasy mini kit Qiagen 74104
RNEASY mini kit Qiagen 74104
RQ1 RNase-free DNase Promega Corp. M6101
SeaPlaque low-melt agarose Lonza Inc. 50101
Sheep serum Sigma-Aldrich S2263-500mL
Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL EMD Millipore SCGPU05RE
Sodium azide, granular Fisher Scientific S227I-100
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific S529-500
SSC, 20X solution Research Products International Corp. S24022-4000.0
SuperScript III first-strand synthesis system Invitrogen 18080-051
T7 RNA polymerase Roche Group 10881767001
Taq DNA polymerase Qiagen 201203
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-1
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100
Vibrating microtome with deluxe specimen bath Leica Microsystems VT1000A
Yeast tRNA Roche Group 109495

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
  2. Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
  3. Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
  4. Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
  5. Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
  6. Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
  7. Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
  8. Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
Высокая пропускная способность<em> На месте</em> Гибридизация метод для характеристики Шаблоны экспрессии мРНК в фетальных Мышь Нижняя урогенитального тракта
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abler, L. L., Mehta, V., Keil, K. P., Joshi, P. S., Flucus, C., Hardin, H. A., Schmitz, C. T., Vezina, C. M. A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract. J. Vis. Exp. (54), e2912, doi:10.3791/2912 (2011).More

Abler, L. L., Mehta, V., Keil, K. P., Joshi, P. S., Flucus, C., Hardin, H. A., Schmitz, C. T., Vezina, C. M. A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract. J. Vis. Exp. (54), e2912, doi:10.3791/2912 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter