Een High Throughput In situ Hybridisatie Methode om mRNA expressie patronen karakteriseren in de Fetal Mouse lagere urogenitale tractus
Summary
We beschrijven hier een efficiënte high throughput<em> In situ</em> Hybridisatie (ISH) methode voor het visualiseren van patronen van mRNA-expressie in de ontwikkeling van de foetus muis prostaatweefsel secties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan de mRNA expressie patronen visualiseren in andere muis weefsels of in de weefsels van andere diersoorten.
Abstract
De ontwikkeling van het lagere urogenitale tractus (LUT) is een ingewikkeld proces. Deze complexiteit blijkt tijdens de vorming van de prostaat van de foetus mannelijk urethra, die zich baseert op androgene signalen en epitheliale-mesenchymale interacties 1,2. Inzicht in de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de prostaat ontwikkeling kan uitwijzen groei mechanismen die ten onrechte zijn later in hun leven opnieuw tot leven gewekt om aanleiding te geven tot prostaat ziekten zoals benigne prostaathyperplasie en prostaatkanker.
De ontwikkelingslanden LUT is anatomisch complex. Tegen de tijd dat de prostaat ontluikende begint op 16,5 dagen na de conceptie (DPC), een groot aantal celtypen aanwezig zijn. Vaatstelsel, de zenuwen en het gladde spierweefsel verblijven binnen de mesenchymale stroma 3. Dit stroma omringt een meerlagig epitheel en geeft aanleiding tot de foetale prostaat via androgeenreceptor-afhankelijk paracriene signalen 4. De identiteit van de stromale androgeenreceptor-responsieve genen die nodig zijn voor de prostaat ontwikkeling en het mechanisme waarmee de prostaat ductaal epitheel vormen in reactie op deze genen niet volledig begrepen. De mogelijkheid om nauwkeurig te identificeren en te lokaliseren soorten cellen de expressie van specifieke factoren in hen is noodzakelijk om verder te begrijpen prostaat ontwikkeling. In situ hybridisatie (ISH) zorgt voor lokalisatie van mRNA's in een tissue. Zo kan deze methode worden gebruikt voor het patroon en de timing van expressie van signaalmoleculen en hun receptoren te identificeren, waardoor het ophelderen van de potentiële prostaat ontwikkeling toezichthouders.
We beschrijven hier een hoge doorvoersnelheid ISH techniek om mRNA expressie patronen te identificeren in de foetale muis LUT met behulp van trillende microtoom gesneden secties. Deze methode biedt een aantal voordelen ten opzichte van andere ISH protocollen. Het uitvoeren van ISH op dunne secties gehandeld op grond van een dia is technisch moeilijk, vriescoupes hebben vaak een slechte structurele kwaliteit, terwijl zowel de vriescoupes en paraffinecoupes resulteren vaak in een zwak signaal resolutie. Het uitvoeren van ISH op hele berg weefsel kan resulteren in een probe vangen. In tegenstelling tot onze high throughput techniek maakt gebruik van dik gesneden secties die gedetailleerde weefsel architectuur zichtbaar te maken. Gewijzigd microfugebuizen buizen een gemakkelijke bediening mogelijk van onderdelen tijdens de ISH procedure. Er kunnen maximaal 4 mRNA transcripten kan worden afgeschermd van een enkele 17.5dpc LUT met maximaal 24 mRNA transcripten gedetecteerd in een enkele run, waardoor de kosten en het maximaliseren van efficiency. Met deze methode kunnen meerdere behandelingsgroepen tot identiek en als een geheel worden verwerkt, zodat er geen voorkeur voor het interpreteren van data. De meeste pertinent voor prostaatkanker onderzoekers, deze methode zorgt voor een ruimtelijke en temporele locatie van de lage en hoge overvloed mRNA transcripten in de foetale muis urinebuis die aanleiding geeft tot de prostaat ductaal netwerk.
Protocol
Discussion
Met behulp van de hier beschreven methode, is het mogelijk om mRNA te detecteren in alle belangrijke soorten cellen en weefsels compartimenten van de foetale mannelijke en vrouwelijke muizen LUT's mogelijk is inclusief de mesenchymale pads, urotheel, glad spierweefsel, prostaat knoppen, ejaculatie kanaal, en de vagina. De 50μm secties die in dit protocol hebben het voordeel dat ze dik genoeg zijn om weefsel architectuur (zoals de bloedvaten) op te lossen, maar zijn dun genoeg om te probe vangen, dat is een methodol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dr. Lan Yi, Cancer Institute van de New Jersey, bedanken voor technische bijstand bij de voorbereiding van weefsel manden. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health Subsidies DK083425 en DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
