תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון
Summary
כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה ויעילה<em> באתרו</em> (שאני עורך) הכלאה שיטת הדמיה דפוסי ביטוי mRNA בפיתוח העובר הערמונית עכבר סעיפים רקמות. השיטה ניתן להתאים בקלות לדמיין ביטוי בדפוסי mRNA ברקמות העכבר אחרים או ברקמות ממינים אחרים.
Abstract
פיתוח בדרכי השתן ואברי המין התחתון (LUT) הוא תהליך מורכב. מורכבות זו לידי ביטוי במהלך היווצרות של הערמונית של השופכה בעובר זכר, אשר מסתמכת על אותות androgenic ו אפיתל-mesenchymal 1,2 אינטראקציות. הבנת המנגנונים המולקולריים האחראים להתפתחות סרטן הערמונית עשוי לחשוף את מנגנוני צמיחה, כי הם לא הולם המתעורר בשלב מאוחר יותר בחיים לעורר מחלות הערמונית כגון היפרפלזיה שפירה של הערמונית וסרטן הערמונית.
LUT פיתוח מורכב מבחינה אנטומית. על ידי הערמונית זמן ניצני מתחיל על התפיסה ימים 16.5 פוסט (DPC), סוגי תאים רבים נוכחים. בכלי הדם, העצבים שריר חלק מתגוררים בתוך stroma mesenchymal 3. Stroma זה המקיף אפיתל רב שכבתי ואת מוליד הערמונית העובר דרך קולטן האנדרוגן תלויים אותות אוטוקריני 4. זהותם של קולטן האנדרוגן סטרומה תגובה הגנים הדרושים לפיתוח הערמונית את המנגנון שבאמצעותו הערמונית צורות ductal אפיתל בתגובה הגנים האלה לא מובנת לחלוטין. היכולת לזהות במדויק סוגי תאים בתרגום הביטוי של גורמים ספציפיים בתוך אותם הוא הכרחי כדי להבין את התפתחות נוספת הערמונית. הכלאה In situ (שאני עורך) מאפשר איתור של mRNAs בתוך הרקמה. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לזהות דפוס והעיתוי של ביטוי של מולקולות איתות הקולטנים שלהם, ובכך הבהרת הרגולטורים הערמונית הפוטנציאל ההתפתחותי.
כאן אנו מתארים תפוקה גבוהה שאני עורך טכניקה לזהות דפוסי ביטוי mRNA ב LUT העכבר העובר באמצעות רטט microtome לחתוך חלקים. שיטה זו מציעה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים אחרים שאני עורך. ביצוע שאני עורך על סעיפים דק דבק שקופית קשה מבחינה טכנית, cryosections לעתים קרובות יש איכות מבנית העניים בעוד הן cryosections וחתכים פרפין לעיתים לגרום ברזולוציה אות חלש. ביצוע שאני עורך על כל רקמות הר יכול לגרום השמנה בדיקה. לעומת זאת, הטכניקה תפוקה גבוהה שלנו מנצל עבה לחתוך קטעים החושפים ארכיטקטורת רקמה מפורט. צינורות microfuge השתנה לאפשר טיפול קל סעיפים במהלך ההליך איש. מקסימום של 4 תעתיקי mRNA יכול להיות מוקרן מן LUT 17.5dpc יחיד עם עד 24 תעתיקי mRNA זוהה בטווח יחיד, ובכך להפחית את עלות ויעילות למקסם. שיטה זו מאפשרת לקבוצות טיפול מרובים כדי להיות מעובד ובשפה כיחידה אחת, ובכך להסיר כל הטיה של הנתונים לפרש. רוב לענייננו לחוקרים הערמונית, שיטה זו מספקת מיקום במרחב ובזמן של תעתיקי mRNA נמוך וגבוה בשפע השופכה עוברי עכבר אשר מעורר ברשת הערמונית ductal.
Protocol
Discussion
באמצעות השיטה המתוארת כאן, אפשר לזהות mRNAs בכל סוגי התאים העיקריים תאים ורקמות של LUTs עוברי עכבר זכר ונקבה כולל רפידות mesenchymal, urothelium, שרירים חלקים, בלוטות הערמונית, צינור השופכה, והנרתיק. הסעיפים 50μm להשתמש בפרוטוקול זה יש את היתרון של להיות עבה מספיק כדי לפתור ארכיטקטור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר לאן יי, מכון הסרטן של ניו ג'רזי, לקבלת סיוע טכני בהכנת סלי רקמות. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים DK083425 ו DK070219.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions–I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
