높은 처리량 현장에서 하이브리드화 방법
Summary
여기, 우리는 효율 높은 처리량을 설명<em> 현장에서</em태아 마우스 전립선 조직 섹션을 개발 mRNA의 표현의 패턴을 시각화를위한> 하이브 리다이 제이션 (봐야죠) 방법입니다. 방법은 쉽게 다른 마우스 조직에서 또는 다른 종 조직에서 mRNA 발현 패턴을 시각화하기 위해 적용할 수 있습니다.
Abstract
낮은 urogenital 트랙트 (LUT)의 개발은 복잡한 프로세스입니다. 이 복잡 androgenic 신호와 상피 – mesenchymal 상호 작용의 1,2에 의존 태아 남성 요도에서 전립선 형성하는 동안 입증합니다. 전립선 개발을 담당하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 부적절 같은 양성 전립선 증식과 전립선 암 등 전립선 질환을 야기할 나중에 삶에 reawakened 아르 성장 메커니즘을 보여줄 수 있습니다.
개발 LUT는 해부학적인 몸의 구조도 복잡합니다. 신진 시간 전립선은 16.5 일 게시 개념 (DPC)에 시작하여 많은 세포 유형이 존재한다. Vasculature, 신경 및 평활근은 mesenchymal 기질 내에 3. 이 기질은 multilayered 상피와 주변 androgen 수용체 의존 paracrine 신호 4 태아 전립선에 상승을 제공합니다. stromal androgen의의 신분 수용체 – 응답 전립선 개발 및 이들 유전자에 대한 응답으로 전립선의 상피 ductal 형태가 완전히 이해되지하는 메커니즘에 필요한 유전자. 정확하게 세포 유형을 식별하고 그들 내의 특정 요소의 표현을 집중하는 능력은 더욱 전립선 개발을 이해하는 필수적입니다. 원위치 하이브리드화 년 (이쉬) 조직 내에서 mRNAs의 국산화에 대한 수 있습니다. 따라서이 방법은이를 통해 잠재적인 전립선 개발 규제를 elucidating, 패턴 및 신호 분자와 그 수용체의 표현의 타이밍을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 진동 마이크로톰 – 컷 섹션을 사용하여 태아 마우스 LUT의 mRNA 발현 패턴을 식별하는 높은 처리량 이쉬 기술을 설명합니다. 이 방법은 다른 이쉬 프로토콜을 통해 몇 가지 장점을 제공합니다. 슬라이드을 준수 얇은 섹션에 이쉬 수행하는 것이 기술적으로 어렵습니다, 모두 cryosections 및 파라핀 섹션은 종종 약한 신호 해상도로 결과를하면서 cryosections 자주 가난한 구조 품질을 가지고 있습니다. 전체 마운트 조직에 이쉬 수행하면 프로브 트래핑이 발생할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 높은 처리량 기술은 세부 조직 아키텍처를 공개 두꺼운 상처 부분을 활용합니다. 수정 microfuge 튜브는 이쉬 절차를 수행하는 동안 부분을 쉽게 처리하실 수 있습니다. 4 mRNA의 성적의 최대함으로써 비용과 효율성 극대화를 줄이고, 최대 단일 실행에서 검색된 24 mRNA의 성적을 가진 단일 17.5dpc LUT에서 심사하실 수 있습니다. 이 방법은 여러 치료 그룹 따라서 해석 데이터에 대한 모든 편견을 제거, 동일하고 하나의 단위로 처리할 수 있습니다. 대부분의 pertinently 전립선 연구원이 방법은 전립선 ductal 네트워크에 상승을 제공 태아 쥐 요도의 낮은 높은 어번던스 mRNA의 성적의 공간과 시간적 위치를 제공합니다.
Protocol
Discussion
방법을 사용하면 여기에 설명된, 그것은 주요 세포 유형 및 mesenchymal 패드, urothelium, 부드러운 근육, 전립선 꽃봉오리, ejaculatory 덕트 및 질을 포함하여 태아 남성과 여성의 마우스 LUTs의 조직 구획의 모든 mRNAs를 감지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 50μm 섹션은 조직 구조 (예 : 혈관 등) 해결하기 위해 충분한 두께가되는 장점을 가지고 있지만 일반적으로 전체 마운트 이쉬 동안 발생한 방?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 조직 바구니 준비에 기술 지원을위한 닥터 란 이순신, 뉴저지의 암 연구소, 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 DK083425 및 DK070219 국립 연구소에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Applied Science | 11214667001 |
| Blocking reagent | Roche Applied Science | 11096176001 |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Applied Science | 11442074001 |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Applied Science | 1277073910 |
| dNTPs | Roche Applied Science | 11969064001 |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 |
| Formamide | Sigma | F5786-1L |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma | G6257-100ML |
| Heparin, sodium salt | Sigma | H3393 |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 |
| Levamisole | Sigma | L9756 |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp. | 46551 |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 |
| Maleic acid | Sigma | M0375-500G |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 |
| Millicell culture plate insert | Millipore | PICM01250 |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 |
| Polyester mesh, 33 micron, 12” x 24” | Small Parts Inc | CMY-0033-D |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase |
| RNase | Sigma | R6513 |
| RNase inhibitor | Roche Applied Science | 03335399001 |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega | M6101 |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza | 50101 |
| Sheep serum | Sigma | S2263-500mL |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | Millipore | SCGPU05RE |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 |
| SSC, 20X solution | Research Products International | S24022-4000.0 |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 |
| T7 RNA polymerase | Roche Applied Science | 10881767001 |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A |
| Yeast tRNA | Roche Applied Science | 109495 |
References
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