هنا ، نحن تصف كفاءة عالية الإنتاجية في الموقع التهجين (ISH) طريقة لتصور أنماط التعبير مرنا في تطوير قطاعات النسيج الجنيني الماوس البروستاتا. ويمكن تكييفها بسهولة طريقة لتصور أنماط التعبير مرنا في الأنسجة الماوس الأخرى أو في أنسجة من الأنواع الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاجية عالية في الموقع أسلوب التهجين لتوصيف أنماط التعبير مرنا في الفأر الجنينية السفلى المسالك البولي التناسلي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تطوير الجهاز البولي التناسلي السفلي (طرفية) هي عملية معقدة. ويتجلى هذا التعقيد خلال تشكيل البروستاتا من مجرى البول الجنين الذكر ، والذي يعتمد على إشارات وأندروجيني الظهارية - الوسيطة 1،2 التفاعلات. قد فهم الآليات الجزيئية المسؤولة عن التنمية البروستاتا تكشف آليات النمو التي أيقظ بشكل غير لائق في وقت لاحق في الحياة أن يؤدي إلى نشوء أمراض البروستاتا مثل تضخم البروستاتا الحميد وسرطان البروستاتا.
وLUT النامية معقدة تشريحيا. من البروستاتا الوقت الناشئين يبدأ في تصور آخر 16.5 يوما (DPC) ، العديد من أنواع الخلايا موجودة. الأوعية الدموية والأعصاب والعضلات الملساء الموجودة داخل سدى الوسيطة 3. هذا سدى يحيط ظهارة متعددة الطبقات ويثير البروستاتا الجنين من خلال مستقبلات الاندروجين التي تعتمد على اشارات نظير الصماوي 4. هوية مستقبلات الاندروجين اللحمية التي تستجيب للجينات اللازمة للتنمية البروستاتا والآلية التي لا تشكل البروستاتا ظهارة الأقنية استجابة لهذه الجينات مفهومة تماما. القدرة على التعرف على أنواع الخلايا بدقة التعبير وتوطين من العوامل المحددة في داخلها لا بد من زيادة فهم التنمية البروستاتا. التهجين في الموقع (ISH) يسمح لتوطين mRNAs داخل الأنسجة. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد نمط وتوقيت التعبير عن جزيئات الإشارات والمستقبلات الخاصة بهم ، وبالتالي توضيح المنظمين المحتملين البروستاتا التنموية.
هنا ، نحن تصف ISH إنتاجية عالية التقنية لتحديد أنماط التعبير مرنا في طرفية الماوس الجنين باستخدام تهتز مشراح قطع المقاطع. هذا الأسلوب يوفر مزايا عديدة أكثر من البروتوكولات ISH الأخرى. أداء ISH على المقاطع رقيقة تنضم إلى شريحة من الصعب من الناحية الفنية ، وكثيرا ما cryosections نوعية الهيكلية الفقراء في حين أن كلا cryosections البارافين والمقاطع غالبا ما تؤدي إلى القرار إشارة ضعيفة. ويمكن أداء ISH على أنسجة جبل بأكمله في محاصرة نتيجة التحقيق. في المقابل ، لدينا إنتاجية عالية التقنية تستخدم قطع سميكة المقاطع التي تكشف بالتفصيل بنية الأنسجة. أنابيب microfuge تعديل تسمح سهولة التعامل من خلال المقاطع الإجراء ISH. ويمكن فحص كحد أقصى المحاضر مرنا 4 من طرفية a 17.5dpc واحد مع ما يصل الى 24 مرنا النصوص المكتشفة في شوط واحد ، وبالتالي تقليل التكاليف وتعظيم الكفاءة. هذا الأسلوب يسمح لمعالجتها معالجة مجموعات متعددة مماثل وكوحدة واحدة ، وبالتالي إزالة أي تحيز لتفسير البيانات. الأكثر تعلقا الباحثين البروستاتا ، وهذا الأسلوب يوفر الموقع المكاني والزماني للالمنخفضة والعالية وفرة النصوص مرنا في مجرى البول الماوس الجنين الذي يولد لشبكة الأقنية البروستاتا.
البروتوكول
1. التوليف من Riboprobe Digoxigenin - 11 - UTP المسمى من قالب PCR - منشأ
- لتوليف riboprobe الجينات المحددة ، واستخدام الجينات Entrez (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) للحصول على تسلسل الجين مرجع [كدنا] (RefSeq). استخدام برنامج Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 لتصميم جينات محددة الاشعال PCR ضد المنطقة 3' - تسلسل [كدنا]. يتم وصف المعلمات الموصى بها لاختيار التمهيدي PCR في مكان آخر (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html).
- اس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، فإنه من الممكن الكشف عن mRNAs في جميع أنواع الخلايا الرئيسية ومقصورات أنسجة الجنين الماوس طرفيات المستعملين المحليين من الذكور والإناث بما في ذلك منصات الوسيطة ، الظهارة البولية ، العضلات الملساء ، براعم البروستاتا ، لاصق قذفي والمهبل. المقاطع 50μm المستخدمة في هذا البروتوكول لديها ميزة كونها سميكة بما فيه الكفاية لحل هندسة الأنسجة (مثل الأوعية الدموية) ، بل هي رقيقة بما فيه الكفاية لتجنب محاصرة التحقيق ، والتي هي مشكلة المنهجية التي تعترض عادة خلال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لان يي ، معهد السرطان في نيو جيرسي ، للحصول على المساعدة الفنية في إعداد سلات الأنسجة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة DK083425 المنح وDK070219.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| Digoxigenin المضادة للأجسام المضادة ، شظايا فاب | روش العلوم التطبيقية | 11214667001 | |
| حظر كاشف | روش العلوم التطبيقية | 11096176001 | |
| BM الركيزة AP الأرجواني ، مما عجل | روش العلوم التطبيقية | 11442074001 | |
| الأبقار مصل الزلال | فيشر العلمية | BP1600 - 100 | |
| خلية لوحة والثقافة ، وكذلك 24 | كورنينج | 3524 | |
| Digoxigenin 11 - UTP | روش العلوم التطبيقية | 1277073910 | |
| dNTPs | روش العلوم التطبيقية | 11969064001 | |
| ذو حدين شفرة الحلاقة | سيف ويلكنسون | الكلاسيكي النموذجي | |
| Eliminase ريبونوكلياز مزيل | التطهير مختبرات | 1102 | |
| Formamide | سيغما | F5786 - 1L | |
| هلام استخراج طقم | Qiagen | 28704 | |
| غلوتارالدهيد ، حل 25 ٪ في H 2 O | سيغما | G6257 - 100ML | |
| الهيبارين ، وملح الصوديوم | سيغما | H3393 | |
| بيروكسيد الهيدروجين ، حل 30 ٪ في H 2 O | فيشر العلمية | BP2633 - 500 | |
| Levamisole | سيغما | L9756 | |
| وكتايت 404 الفورية تعيين سريع لاصقة | شركة هنكل | 46551 | |
| كلوريد المغنيسيوم | فيشر العلمية | M33 - 500 | |
| المالئيك حمض | سيغما | M0375 - 500G | |
| أنابيب Microcentrifuge ، 1.5mL | Biologix أبحاث الشركة | BP337 - 100 | |
| Millicell إدراج الثقافة صفيحة | ميليبور | PICM01250 | |
| الجزيئية الراتنج طحن | G - العلوم البيولوجية | 786 - 138PR | |
| مخزنة بارافورمالدهيد ، 4 ٪ في حل الفوسفات المالحة | Affymetrix | 19943 | |
| الفوسفات مخزنة المالحة ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم | النائب Biomedicals | ICN1760420 | |
| البوليستر شبكة ، و 33 ميكرون ، 12 "× 24" | شركة صغيرة وقطع غيار | CMY - 0033 - D | |
| بروتين K الحل ، 20mg/ml | Amresco | E195 - 5ML | |
| QIAshredder أعمدة | Qiagen | 79654 | |
| س الحل | Qiagen | قدمت مع الحمض النووي بوليميريز طق | |
| ريبونوكلياز | سيغما | R6513 | |
| ريبونوكلياز المانع | روش العلوم التطبيقية | 03335399001 | |
| RNeasy مجموعة مصغرة | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY مجموعة مصغرة | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 ريبونوكلياز خالية الدناز | Promega | M6101 | |
| SeaPlaque منخفضة ذوبان agarose | Lonza | 50101 | |
| مصل الأغنام | سيغما | S2263 - 500mL | |
| Stericup تصفية الوحدة ، 0.22μm ، polyethersulfone ، 500mL | ميليبور | SCGPU05RE | |
| أزيد الصوديوم ، والحبيبية | فيشر العلمية | S227I - 100 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر العلمية | BP358 - 212 | |
| كبريتات الصوديوم دوديسيل | فيشر العلمية | S529 - 500 | |
| محكمة أمن الدولة ، 20X الحل | بحث البرامج والخطط الدولية | S24022 - 4000.0 | |
| ثالثا مرتفع النظام التوليفي الأول الجديلة | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي | روش العلوم التطبيقية | 10881767001 | |
| طق الحمض النووي بوليميريز | Qiagen | 201203 | |
| تريس ، حمض الهيدروكلوريك | فيشر العلمية | BP153 - 1 | |
| توين 20 | فيشر العلمية | BP337 - 100 | |
| مشراح تهتز مع حمام ديلوكس العينة | لايكا مايكروسيستمز | VT1000A | |
| الخميرة الحمض الريبي النووي النقال | روش العلوم التطبيقية | 109495 |
المراجع
- Cunha, G. R. The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice. Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).
- Cunha, G. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
