Summary
ここで、我々は、効率的な高スループットを記述
Abstract
下部尿生殖路（LUT）の開発は複雑なプロセスです。この複雑さは、アンドロゲンシグナルと上皮-間葉相互作用の1,2に依存している胎児の男性の尿道から前立腺の形成の間に証明されています。前立腺の開発を担当する分子メカニズムを理解することは不適切にそのような良性前立腺肥大症や前立腺癌などの前立腺疾患を生じさせるために、その後の人生に呼び覚ますされている成長メカニズムを明らかにすることがあります。
開発LUTは、解剖学的に複雑です。出芽時の前立腺は16.5日後の構想（DPC）で始まることにより、多数の細胞タイプが存在する。血管系、神経や平滑筋は、間葉系間質3内に存在する。この基質は、多層上皮を囲み、アンドロゲン受容体依存性傍分泌シグナル4を介して胎児の前立腺を生じさせる。前立腺の開発とこれらの遺伝子に対応して前立腺管の上皮の形態は完全には理解されていないメカニズムのために必要な間質アンドロゲン受容体応答性遺伝子のアイデンティティ。正確に細胞の種類を識別し、それらの内の特定の因子の発現をローカライズする機能は、さらに前立腺の開発を理解することが不可欠です。in situハイブリダイゼーション （ISH）組織内のmRNAの局在化が可能になります。したがって、このメソッドは、それによって潜在的な前立腺の発達レギュレータの解明、シグナル分子とその受容体の発現のパターンとタイミングを識別するために使用することができます。
ここで、我々は、振動ミクロトームカットのセクションを使用して、胎児マウスのLUTでmRNAの発現パターンを識別するために、高スループットのISH法を説明します。このメソッドは、他のISHのプロトコルに比べていくつかの利点があります。スライドに付着した薄い切片上でISHを実行すると、技術的に困難であり、凍結切片やパラフィン切片の両方がしばしば弱い信号の解像度をもたらす間、凍結切片は、頻繁に悪い構造の品質を持っている。全体のマウント組織でISHを実行すると、プローブのトラッピングが発生する可能性があります。対照的に、私たちのハイスループット技術は、詳細な組織構造を明らかに分厚く切ったセクションを利用しています。修正されたマイクロチューブは、ISH手順の実行中にセクションを簡単に処理できます。 4 mRNAの転写産物の上限は、それによってコストと最大化効率を減少させる、一度の実行で検出された24のmRNA転写産物を最大で単一の17.5dpc LUTからスクリーニングすることができる。このメソッドは、それによってデータを解釈するための任意のバイアスを除去し、同じ単一のユニットとして処理される複数の治療群を可能にします。最も適切に前立腺の研究者のために、この方法では、前立腺管のネットワークを生じる胎児マウスの尿道が低く、高い多量のmRNA転写物の空間的、時間的な場所を提供します。
Protocol
1。 PCR -生成されたテンプレートからジゴキシゲニン- 11 - UTP -標識リボプローブの合成
- 遺伝子特異的リボプローブを合成するには、遺伝子cDNAの参照配列（RefSeqデータベース）を取得するためにEntrezの遺伝子を（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）を使用します。 cDNA配列の3'末端領域に対する遺伝子特異的PCRプライマーを設計するPrimer3のプログラム（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）5を使用してください。 PCRのプライマーを選択するための推奨されるパラメータは、他の場所（http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html）に記載されています。
- 選択されたDNA配列の特異性を評価するために、MegaBLASTプログラム（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090）6を使用してください。 0.01の期待しきい値を使用する場合は、DNA配列が特定の考えられている、それは、RefSeqデータベース内の他の配列に合わせて配置されることはありません。
- PCRは、リボプローブのテンプレートを増幅する。 PCRの反応成分と熱サイクル条件は、各プライマーセットのために最適化する必要があります。典型的な50μlの反応が含まれています：1Xバッファー、2mMのMgCl 2を 、0.2のdNTP、1 × Qのソリューション、1μgのcDNAを、2.5U Taq DNAポリメラーゼ、0.25プライマー、およびヌクレアーゼフリーH 2 Oを典型的な熱サイクルプロトコルは94で、最初の変性° 30秒、94℃での40サイクルに続いて2分のためのC、57℃30秒のためのC、72℃1分及び10分間72℃で、最終的な拡張のためのCが含まれています。 PCR反応で使用されているcDNAはマウス泌尿生殖器のmRNAから合成される。
- アガロースゲル電気泳動によってPCR産物を分離、ゲル抽出キットを用いて精製し、分光光度法により精製した製品を定量化する。 3.6μg - 期待利回りは1.2です。
- 標識リボプローブにPCR産物を転写。転写反応（40μlのは）が含まれています：400ng精製したPCR産物を、ジゴキシゲニン11 - UTP、1X転写バッファー、5U RNase阻害剤、80U T7 RNAポリメラーゼ、およびヌクレアーゼフリーH 2 Oを含む1Xヌクレオチドラベリングミックスを37インキュベート3 - 4時間℃、撹拌機でサンプルごとに30分。
- カラム上でDNase分解とRNAのクリーンアップのための指示に基づいてリボプローブを精製するためにキアゲンRNeasyミニキットを使用してください。分光光度法によりリボプローブを定量する。予想される収量は,4 - 20μgです。 1.5パーセント、非変性アガロースゲル電気泳動でアリコートを分離することにより、プローブの品質を評価する。高品質のプローブは、最小限のスミアと明瞭なバンドとして移行。
- リボプローブは、特に、そのターゲットを認識できるようにするには、まず、ISH実験のポジティブコントロールの組織が含まれています。リボプローブの標的mRNAのパターンは、この陽性対照の組織に知られている必要があります。
2。ミクロトーム振動刃の準備（前述のプロトコルに基づいて）7
- リン酸塩は4％低融点アガロース溶液を調製する緩衝食塩水（PBS）。アガロースを溶解し、62で解決策を維持するために、マイクロ波ソリューション℃に
- よくアガロースの型として使用するポリスチレンのリングを挿入し、保持する直径12 mm Millicell培養プレートから細胞膜を除去することによってポリスチレンのリングの金型を準備します。各使用前にRNase阻害剤の溶液中で一晩リングを浸します。
- 滑らかな加工面を確保するため、100％の濃度で、次の溶剤で洗浄することによってウィルキンソンの刃の表面から防錆剤および他の添加剤を削除する：石油エーテル、キシレン、クロロホルム、メタノール、およびMilliQ水を。つのシングルブレードに縦に二重刃を区切ります。
- ロックタイト接着剤を用いたミクロトーム刃にウィルキンソンのブレードを付着する。ミクロトーム刃は、切断のために使用されていない、それがウィルキンソンのブレードに剛性を追加します。ウィルキンソンブレードの最先端から4mm - ミクロトーム刃は金属の鋏と、一度付着を使用して、ウィルキンソンのブレードの長さに切断する必要がある、3によって相殺されるべきである。
3。セクショニングの泌尿生殖器系組織の解剖、保存、および準備
- PBSTw液を調製（PBS、0.1％を含むトゥイーン™20および0.22μmStericupを通して濾過0.2mmのアジ化ナトリウム、®フィルターユニット）。ソリューションは事前に準備し、25℃で保存することができます。
- 4℃で一晩たての解剖マウスのLUT（膀胱、骨盤尿道、および関連するウォルフとMϋllerian管由来の構造）をインキュベートしますPBSでCは4％パラホルムアルデヒド固定液を含む。
- 25℃で10分間の洗浄° Cの等級メタノール/ PBSTw（1:3、1:1、3:1 v / v）のソリューションのシリーズのことで組織を脱水する。一晩少なくとも100％メタノールで-20℃で保存するサンプル。アーカイブされた組織は、少なくとも2yrに保つことができる。
- アーカイブされた組織を再水和することによってセクショニングの組織を準備します。 25 °傾斜メタノール/ PBSTwの一連のC（3:1、1:1、1:3 v / v）のソリューションで10分間洗浄する。
- 摘出し、尿道に接続された三角領域のほとんどを残して、膀胱の約3分の2を捨てる。
- 25 ° Cプレーンガラスの顕微鏡スライド上に、下にポリスチレンのリング型、平らな面に置きます。
- 62 ° Cアガロース溶液と2分程度のためのクールでリングの金型を埋める。
- PBSTwからLUTの組織を取り出して、ワイプ吸水性で乾燥したブロット。
- アガロース溶液中に組織を移す。
- それは、リング型の上部と下部の中間に中断されるように向きをアガロースでLUT組織を鉗子を使用し、アガロースが固化するまで4℃で組織をインキュベートする。
- 組織はアガロースの凝固の過程で完全にシンクした場合、それはアガロースと再埋め込みから切り出すことができる。再埋め込みプロセスの中に必要に応じてアガロースの冷却時間を調整します。
5。振動ミクロトーム（前述のプロトコルに基づいて）7では泌尿生殖器組織をセクショニング
- 振動ミクロトームで補強ウィルキンソンブレードをマウントし、35 °のブレードの角度を設定します。試料槽の周りPBSとパック濡れた氷でいっぱいに豪華な標本のバス。
- リングの金型から固化したアガロースプラグを外し、ワイプ吸水と底面を覆い隠す。組織の向きが正しいことを確認します。組織の方向は、ベベルアガロースプラグの平らな縁をするためにカミソリの刃を使用して調整することができます。
- 図に示すようにロックタイト接着剤を使用してディスクをマウント振動ミクロトームの試料の上にアガロースプラグを付着。 1A。
- ビブラトームに試料取付ディスクを挿入します。
- 4に50μmの、2〜スピード、およびブレードの振幅にミクロトーム切片厚を調整し、組織切片を切断開始。
- 氷冷した0.5mLをPBSTwが含まれているだけでなく、24穴培養プレートに各組織切片（ 図1B）を転送する鈍鉗子を使用してください。
- 各組織切片の周囲に、in situハイブリダイゼーションのためにアガロースの物品のほとんどをサンプルを準備するには（残っているアガロースがISH手順の実行中に溶けてしまう）と、関連するすべての残骸を削除します。 4℃で48hrへのストアセクション°までPBSTwのC。
6。 in situハイブリダイゼーションのためのサンプルバスケットの準備
- 100μLのマークでマイクロ遠心チューブの底を切る。
- プラスチックが軟化するまで火炎の管の切断端を加熱し、0.5インチポリエステルメッシュの四角の中央にしっかりとマイクロ遠心チューブを押してください。
- 過剰なメッシュのトリミングとバスケットの準備（ 図1C）を完了するために各チューブの蓋に穴を開ける二つの穴に加熱された18ゲージの針を使用してください。
- 24ウェルプレートの蓋を取り外し、各ウェル上の中心12ミリメートルの穴をドリル。 ISHのプロトコルの洗浄（ 図1D）の間に、サンプルバスケットを転送するために蓋を使用してください。
7。 in situハイブリダイゼーションの胚粉末の調製（前述のプロトコルに基づいて）8
- 同じ評価されている組織切片のような段階、-80℃で保存であるマウスからマウス胚の組織を収集する液体窒素でセラミックモルタル、水没の組織に凍結組織を配置し、微粉末に組織を粉砕する乳棒を使用してください。
- アセトンの4巻で胚の粉を組み合わせるとDounceホモジナイザーの複数のストロークでホモジナイズする。
- 15mlのガラススクリュートップバイアルにホモジネートし、4℃で一晩抽出転送℃に
- 4℃で10分間5000rpmで遠心分離によってペレットの胚の粉℃の削除し、脂質含有上清を捨てる。新鮮なアセトンの4volで組織ペレットを再懸濁し、4℃で2時間のために抽出℃に
- ペレット4℃10分間5000rpmで遠心分離により胚の粉℃の削除し、上清を捨てる。
- 空気は、＃2ワットマンろ紙上にペレットを乾燥させる。 4℃で密閉ガラスバイアルで微粉末とストアを生成するためにペレットを粉砕℃におおよその収率は1gの胚湿重量あたり50 mgの粉末である。
8 in situハイブリダイゼーションの1日目で
- 60.5に予熱プレハイブリダイゼーション溶液（50％ホルムアミド、5X SSC、1％ブロッキング試薬、-2010μg/mL酵母tRNA、10μg/mLヘパリンストア° C）℃このソリューションは事前に準備し、-20℃で保存することができます
- 水道水のに約0.5で、小さなプラスチック製貯蔵容器を充填することにより加湿ハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。 60.5℃にコンテナと予熱をカバー
- 24ウェル培養プレートのウェルに2mLのPBSTwを追加。バスケット（バスケットあたり最大10のセクションが使用されている）に24ウェルプレートのフタと転送の組織切片の穴の場所のサンプルバスケット。
- 25℃で30分のための組織切片をインキュベート℃で6％のC H 2 O 2。別段の記載がない限り、後続のすべてのインキュベーションは、オービタルシェーカー上で穏やかに撹拌しながら行われるべきである。全てのインキュベーションDの洗浄は、24ウェルプレートで行われ、2mL/wellのトータルソリューションのボリュームを使用しています。
- 25 ° PBSTwのCで組織切片を4 × 5分を洗浄する。
- 25℃で12分のための組織切片をインキュベートしますPBSTwでCが5μg/mLプロテイナーゼKを含む
- 25 ° PBSTwのCで組織切片を1 × 5分を洗浄する。
- 25℃20分のポストフィックスの組織切片° PBSでCは4％パラホルムアルデヒドおよび0.2％グルタルアルデヒドを含む。
- 組織切片を25℃で2 × 5分° PBSTwでCを洗ってください。
- 予熱プレハイブリダイゼーションバッファーの2mL/wellを追加し、60.5で少なくとも1時間のための加湿ハイブリダイゼーションチャンバー℃の内部で組織切片をインキュベート
- 60.5で加湿ハイブリダイゼーションチャンバーで一晩各ウェルでインキュベート組織切片でのプレハイブリダイゼーションバッファーに0.65μg標識リボプローブを追加℃に
9 in situハイブリダイゼーションの2日目で
- ソリューション1（50％ホルムアミド、5X SSC、1％SDS）、ソリューション2を（10mMのトリス - 塩酸pH7.5、0.5MのNaCl、0.1％ツイーン™20、0.2mmのアジ化ナトリウム：ポストハイブリダイゼーションの洗浄の手順については、次の溶液を調製、フィルタ処理さ0.22μm）、および解決方法3（2 × SSC、50％ホルムアミド）。これらのソリューションは事前に準備することができます。ソリューション1と3は、-20℃で保存されています° Cと溶液2を25℃で保存されていますソリューションの保存寿命は、少なくとも3ヶ月です。
- 60.5で組織切片を3 X 30分を洗う° C予め温めておいたソリューション1と。洗浄中に加湿チャンバーを使用してください。
- 60.5で組織切片を1 × 10分を洗う° C予め温めておいたソリューション1/Solution 2（1:1 v / v）で解を持つ。洗浄時の加湿チャンバーを使用してください。
- 解決策2で25℃で組織切片を4 X 10分を洗ってください。
- 37℃15分のための組織切片をインキュベートします0.25μg/mLRNaseを含む解決策2でCを。
- 組織切片1 25時× 10分°解決策2でCを（RNaseをせずに）洗浄する。
- 25℃の組織切片には1 × 10分を洗う℃で2 X1hr続いソリューション3とCは、解決方法3で60.5℃で洗浄する。 60.5 ° Cの洗浄中に加湿チャンバーを使用してください。
- DIG標識リボプローブの免疫組織化学的検出のために以下の溶液を調製します：組織ブロッキングバッファー（TB、1X TBS、10％ヒツジ血清、1％ブロッキング試薬、1％BSA、0.1％のTween™20、0.22μmのフィルタ処理）、抗体の希釈には、バッファ（AD、1xTBS、5％ヒツジ血清、1％ブロッキング試薬、1％BSA、0.1％のTween™20、0.2mmのアジ化ナトリウム、0.22™mはフィルタ処理された）抗体吸収のバッファー（AA、1xTBS、5％ヒツジ血清、1 ％ブロッキング試薬、1％BSA、6mg/mL胚の粉）、およびTBSTw（1xTBS、0.1％のTween™20、0.2mmのアジ化ナトリウム、0.22μmのフィルタ処理）。これらのソリューションは事前に準備することができます。 TBSTwは25℃で保存されている、他のすべてのソリューションは、-20℃で保存されています
- 25 3 × 10 minでTBSTwとCを洗ってください。
- 25少なくとも2時間° C TBのバッファーで切片をインキュベートします。
- 組織は、TBのバッファーでインキュベートしている間、各ウェルの200μLAAバッファあたり1.1μL抗DIG抗体を加える。インキュベートAAバッファ+抗体4℃で少なくとも2時間℃で、その後1分間10,000 rpmで遠心。 AAバッファ上清を削除し、ADのバッファーの2mLのに追加します。
- TBバッファから組織切片を削除し、4℃で加湿チャンバーで、それらは一晩インキュベート° C抗体を含むADバッファに格納します。
10 in situハイブリダイゼーションの3日目で
- カラー開発ソリューションNTMT（100mMのトリス- HCL pHは9.5、100mMのNaClを、50mmのMgCl 2を 、0.2mmのアジ化ナトリウム、0.22μmフィルタ処理）を準備する。このソリューションは事前に準備し、25℃で保存することができます。使用直前に、2mmのレバミゾールと0.1％のTween™20を追加します。
- 4の井戸とストアソリューション℃から抗体溶液を（ADバッファ+抗体）を取り外しますそれは、さらに2回まで再利用することができます。
- 25 8 X 10分の組織を洗う° TBSTwとCは、2mmのレバミゾールを含む。
- 慎重にTBSTwを含むペトリ皿にバスケットから組織を移す。目に見える破片を削除するには、ピンセットを使用してください。きれいなマイクロ遠心チューブに組織を移す。
- 組織を25で1 × 10 minで1mLのNTMTとCを洗ってください。
- NTMTを削除し、25℃、光、保護ボックスとインキュベートで50％のNTMT（2mmのレバミゾールを含む）と50％BMパープル、場所の管を含む混合物の1mL/tube℃を追加発色時間は数時間から数日の範囲である。色の開発が遅い場合は、100％BMパープルを使用することができます。
- モニターの発色と、それが析出した結晶を蓄積する場合、またはそれが紫に黄色からの色の変化を受ける場合NTMT / BMパープルソリューションを変更してください。フルカラーの開発の後（4〜250時間）、洗浄組織2 X 5分25℃NTMT含む2mmのレバミゾールの1mL/tubeとC。
- 一晩4組織をインキュベートしますPBSの1mL/tubeのCは、4％パラホルムアルデヒド後固定液を含む。
- 漂白剤に組織、25℃30分インキュベート組織゜PBSTwの1mL/tubeのCは、3％H 2 O 2を含む
- 組織切片は、スライドガラスにマウント封入、および化合物の顕微鏡で撮像されています。
11。代表的な結果：
アガロースのLUT組織の空間的な向きは、組織切片の平面を決定します。矢状のセクションでは、膀胱の少なくとも三分の二を摘出され、残りのLUTの組織は、尿道正中は、アガロースプラグ（ 図1A）の平らな面に平行になるように寒天に埋め込 まれています。組織面でのマイナーな調整はアガロースプラグの平らなエッジを面取りによって行うことができます。この平面に配向17.5dpc男性LUTの組織からの代表的な矢状断面を図1Bに示されています。
サンプルバスケットは損失からと複数日ISH手順の間に埃や粒子状物質の蓄積から繊細な組織切片を保護する。サンプルバスケットを1.5mlのマイクロチューブの切り口（ 図1C）にポリエステルメッシュを溶融することによって調製される。小さな穴がにとバスケットの外液の流れを容易にするために、各サンプルのバスケットの蓋に穴を開けています。サンプルバスケットは24ウェルプレートの蓋（ 図1D）ドリル12ミリメートルの穴に配置することにより、ISHソリューションで中断されます。修正されたプレートの蓋は、それらが解の変化の間に24ウェルプレートの間で転送されているバスケットをサポートしています。
それは、低濃度のmRNAの検出に必要な長い潜伏期間中に非特異的なバックグラウンド染色を制限するために挑戦している。 0.22μmフィルターを通してサンプルバッファとその後続のろ過に0.2mmのアジ化ナトリウムの添加は、バックグラウンド染色（図2）を制限するように見えた。ここに記載された方法を用いて、サンプルが長時間の期間（ 図3）については発色溶液中でインキュベートされるとき、バックグラウンドの染色では、明白な違いがあるように表示されません。
マウス下の泌尿生殖器（LUT）管の組織切片の図1。調製とマイクロ遠心チューブISHのためのバスケット。膀胱、骨盤尿道および関連ウォルフとMϋllerian管由来の構造）の一部を含むLUTを4％低融点アガロースの円筒形のプラグに組み込まれています。 （A）プラグは、試料ディスクをマウントするために接着されており、（B）振動ミクロトームで50μmの部分に切断。 （C）LUTのセクションは、チューブの切断底の端にチューブの蓋との融合ポリエステルメッシュに穴を貫通することにより調製されるマイクロ遠心チューブバスケットに転送されます。組織切片をISHのプロトコルの間に緩衝液に懸濁されているように（D）マイクロ遠心チューブ、24ウェルプレートのフタに穴12ミリメートルの穴に挿入されます。矢頭は、アガロースプラグのLUT組織を示している。
図20.22μmフィルタ処理されたソリューションに0.2mmのアジ化ナトリウムの定款は、組織の品質を向上させ、バックグラウンド染色を低減します。 17.5dpc雄マウスより低い泌尿生殖器官（LUTは）50μmの厚さに矢状面での切片。組織切片は、ツイストのホモログ1に対して指向されたプローブを使用してISHにより染色した。 ISHのために使用される緩衝液は（）0.22μm濾過し、0.2mmのアジ化ナトリウム（NaAz）または（B）フィルタ処理されていないとNaAzを添加しないで補足されたのどちらか。矢頭は、バックグラウンド染色を示している。画像を同じ倍率で捕獲された。結果は 、n = 3リットルから独立したマウスの代表的な染色パターンです。
図3。グラウンドの染色強度は、長期発色を高めるためには表示されません。 17.5dpc雄マウスより低い泌尿生殖器官（LUTは）50μmの厚さに矢状面での切片。セクションは、（B）43.5h用培地豊かさを認識するプローブを用いて、（A）9.5hの高い豊富な転写産物エストロゲン関連受容体γ（Esrrg）を認識するプローブを使用するためのchromagen染色液でそれらをインキュベートすることにより、ISHにより染色した亜鉛フィンガードメインに隣接するトランスクリプトのブロモドメイン、2A（Baz2a）、または（C）低濃度の転写翼のないタイプのMMTVの統合サイトファミリー、メンバー10A（Wnt10a）を認識するプローブを用いて236hため 。画像を同じ倍率で捕獲された。結果は 、n = 3リットルから独立したマウスの代表的な染色パターンです。
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Discussion
方法ここで説明を使用して、それは間葉系パッド、尿路上皮、平滑筋、前立腺芽、射精管、および膣を含む胎児の雄と雌のマウスのLUTの主要な細胞型と組織区分のすべてのmRNAを検出することが可能である。このプロトコルで使用さ50μmのセクションでは、組織のアーキテクチャ（例えば、血管など）を解決するために十分な厚さという利点を持っていますが、一般的にホールマウントISH中に発生した方法論的問題であるプローブのトラッピングを、避けるために十分に薄いです。すべての新しいリボプローブは、染色前の発表された研究で評価されている陽性対照の組織、に評価される。我々は、染色パターンは、これらの組織に特異的であることを確認してください。提案手法のもう一つの利点は、複数のmRNAのパターンは同じLUTの組織から、隣接する組織切片で評価することができるということです。さらに、この方法は、細胞特異的タンパク質マーカーを視覚化し、ISHプロトコールで染色した細胞の種類を識別するために、免疫組織化学法と組み合わせて使用することができます。このメソッドは、ファストレッドまたはヘマトキシリンで核の対比染色として伝統的な対比の方法、互換性がありません。しかし、我々は、4を含む蛍光核染色、'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）とヨウ化プロピジウムで正常に対比のサンプルを持っている。
ここで説明する方法は、以前に7に記載されたものに比べていくつか改善されています。ほとんどすべての現在の原稿のバッファと試薬の原液のは、事前に用意されており、効率を向上させる、長期間、保存することができます。 0.22μm膜を介してほとんどの試薬とそのろ過に0.2mmのアジ化ナトリウムの添加は非常に非特異的なバックグラウンド染色を減少させる、ISH手順の間に組織切片上の試薬の貯蔵寿命、および粒子状物質の最小化蓄積を増加させる。この原稿はまた、ISHやバッファの変更中にバスケットを保持する改変マルチウェル培養プレートのふたの間に組織切片を含む透過性のマイクロ遠心チューブのバスケットの製造を説明します。我々は、容易に実験室で製造されているこれらのデバイスは、、、サンプルのロスを低減、処理中に組織切片の損傷を最小限に、そして効率性を向上させることがわかった。また、湿度のチャンバーのような密閉式プラスチック容器の使用は、蒸発を防ぐのに役立ちます。これは、いわゆる"エッジ効果"は実験的な変数を導入することができる末梢サンプルウェル、で組織切片では特に重要です。湿度のチャンバーを使用している間、我々は末梢対内側のサンプルウェルにかなりの染色質の違いを確認されていません。
このプロトコルは、マウスのLUTの組織においてmRNAの発現パターンを研究するために効率的なメカニズムですが、この方法では、いくつかの制限があります。 mRNAの検出の効率は、リボプローブの間で変化し、mRNAの絶対的な存在量を決定することができない。別の制限は、染色パターンは、断面平面によって変わることができることです。これらの制限を最小限に抑えるために、我々は、複数の落葉から独立した胎児からの複数のセクション内の各mRNAのパターンを評価する。
このメソッドは、他のマウス組織の種類または他の種のmRNAの発現パターンを可視化するために最適化することができます。そのような変更は、ミクロトーム刃の振幅と速度が組織切片中に最適化されるとそのプロテイナーゼKの濃度がISH手続き中に最適化されている必要があります。さらに、それはISHによって評価されている組織の同じ種からの胚の粉末で、抗ジゴキシゲニン抗体を事前に吸収する必要があります。この方法は、セクションでは、ISH染色中に崩壊するので、それは高スループットのホールマウントISH染色での使用に適合させることができる。、40ミクロンよりも薄い組織切片のための有用ではないが、我々は、胎児や新生児のマウスの前立腺だけでなく、胎児の生殖腺と腎臓の全体のマウントISHを行うことを正常にこのメソッドを使用している。ホールマウントISH染色には、プロテイナーゼK組織の消化だけでなく、プローブのトラッピングに起因するバックグラウンド染色を低減するために一晩抗体のインキュベーション後の洗浄の量と持続時間を最適化する必要があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、組織のバスケットの準備に技術支援のために博士が蘭李、ニュージャージー州のがん研究所を、感謝したいと思います。この作品は、健康補助金DK083425とDK070219の国民の協会によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Digoxigenin antibody, Fab fragments | Roche Group | 11214667001 | |
| Blocking reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| BM Purple AP substrate, precipitating | Roche Group | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Cell culture plate, 24 well | Corning | 3524 | |
| Digoxigenin 11-UTP | Roche Group | 1277073910 | |
| dNTPs | Roche Group | 11969064001 | |
| Double-edged razor blade | Wilkinson Sword | Classic Model | |
| Eliminase RNase remover | Decon Laboratories | 1102 | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F5786-1L | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Glutaraldehyde, 25% solution in H2O | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| Heparin, sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Hydrogen peroxide, 30% solution in H2O | Fisher Scientific | BP2633-500 | |
| Levamisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| Loctite 404 quick set instant adhesive | Henkel Corp | 46551 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375-500G | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5mL | Biologix Research Company | BP337-100 | |
| Millicell culture plate insert | EMD Millipore | PICM01250 | |
| Molecular grinding resin | G-Biosciences | 786-138PR | |
| Paraformaldehyde, 4% solution in phosphate buffered saline | Affymetrix | 19943 | |
| Phosphate buffered saline, without Ca & Mg | MP Biomedicals | ICN1760420 | |
| Polyester mesh, 33 micron, 12" x 24" | Small Parts, Inc. | CMY-0033-D | |
| Proteinase K solution, 20mg/ml | Amresco | E195-5ML | |
| QIAshredder Columns | Qiagen | 79654 | |
| Q solution | Qiagen | Provided with Taq DNA polymerase | |
| RNase | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| RNase inhibitor | Roche Group | 03335399001 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNEASY mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RQ1 RNase-free DNase | Promega Corp. | M6101 | |
| SeaPlaque low-melt agarose | Lonza Inc. | 50101 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263-500mL | |
| Stericup filter unit, 0.22μm, polyethersulfone, 500mL | EMD Millipore | SCGPU05RE | |
| Sodium azide, granular | Fisher Scientific | S227I-100 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | S529-500 | |
| SSC, 20X solution | Research Products International Corp. | S24022-4000.0 | |
| SuperScript III first-strand synthesis system | Invitrogen | 18080-051 | |
| T7 RNA polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| Taq DNA polymerase | Qiagen | 201203 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Vibrating microtome with deluxe specimen bath | Leica Microsystems | VT1000A | |
| Yeast tRNA | Roche Group | 109495 |
References
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- Cunha, G. R. Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).
- Price, D. Comparative aspects of development and structure in the prostate. National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).
- Cunha, G. R. Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice. Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).
- Rozen, S. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).
- Zhang, Z. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).
- Vezina, C. M. Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate. Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).
- Wilkinson, D. G. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).
